S-腺苷蛋氨酸对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞增殖及胶原表达的影响

发布时间：2020-06-18 01:19

【摘要】： 目的：肝纤维化(hepatic fibrosis, HF)是各种慢性肝损伤向肝硬化发展的中间阶段,其发生与发展受多种因素调控,但其中心环节是各种刺激因子诱导肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)的活化及增殖,并产生大量的细胞外基质(extracellular matrix, ECM),沉积于肝组织中,进一步发展即形成肝硬化。因此,抑制HSCs的活化与增殖、诱导其凋亡是阻止肝纤维化发生与发展的关键。S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl-mehionine, SAM)是由蛋氨酸与三磷酸腺苷在腺苷蛋氨酸合成酶作用下催化合成的一种天然化合物,广泛存在于人体各种组织和体液中,参与体内多种生化反应,是生物甲基化反应的必需中间体,直接为甲基受体提供甲基。另外,SAM还可通过转硫作用在体内合成一种重要的还原物质,即谷胱甘肽(glutathione, GSH),对抗氧自由基及炎性物质对细胞的损伤。目前,外源性的SAM在临床上主要被用于治疗各种病因引起的肝内胆汁淤积,其机制与SAM提供甲基和转硫基作用相关。低甲基化状态与酒精性肝病引起的肝纤维化有密切的关系,SAM作为生物甲基化的必需中间体,在理论上有可能影响肝纤维化的过程。本研究旨在观察SAM对乙醛(acetaldehyde, AA)刺激的体外培养的大鼠HSCs增殖、形态变化以及Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达的影响,为SAM在临床上用于预防和治疗肝纤维化提供理论依据。方法：体外培养大鼠肝星状细胞株(HSC-T6),将细胞分为空白对照组、乙醛对照组(200μmol/L)、0.15mmol/L SAM组(0.15 mmol/L SAM+200μmol/L AA)、0.5 mmol/LSAM组(0.5 mmol/L SAM+200μmol/L AA)、1.5 mmol/L SAM组(1.5mmol/L SAM+200μmol/L AA)、5.0 mmol/L SAM组(5.0 mmol/L SAM+200μmol/L AA)、15.0 mmol/L SAM组(15.0 mmol/L SAM+ 200μmol/LAA), SAM干预培养1h后再加入乙醛,培养24h后采用光学显微镜观察细胞形态变化,MTT法检测细胞增殖。依据实验结果,选择其中的两个剂量用于后续实验。将细胞分为空白对照组、乙醛对照组(200μmol/L)、1.5 mmol/L SAM组(1.5 mmol/L SAM+200μmol/L AA)、5.0 mmol/L SAM组(5.0 mmol/L SAM+200μmol/L AA), SAM干预培养1h后再加入乙醛,培养24h后采用反转录聚合酶链式反应(Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)和Western-blot检测细胞Ⅰ型及Ⅲ型胶原的表达。结果：1.倒置显微镜下见空白对照组HSC-T6细胞生长良好,呈梭形或星形。与对照组比较,乙醛对照组细胞数目增多,排列密集,细胞间间隙更小,细胞周边伪足更多更长,胞体呈星形或不规则形。与乙醛对照组比较,SAM干预培养的各组细胞数目减少,细胞间的间隙增大,细胞周边伪足减少,细胞呈短梭型或扁平形,并随着SAM浓度的升高,此变化更加明显。2.MTT法检测结果显示,空白对照组、乙醛对照组、0.15 mmol/L SAM组、0.5 mmol/L SAM组、1.5 mmol/L SAM组、5.0mmol/L SAM组、15.0 mmol/L SAM组的吸光度值(OD值)分别为(x±s)：0.463±0.0038、0.698±0.014、0.445±0.026、0.415±0.029、0.391±0.012、0.342±0.024、0.223±0.025。与空白对照组比较,乙醛对照组OD值明显升高,差异有统计学意义(P0.01)。与乙醛对照组比较,SAM干预的各组OD值均明显降低,差异有统计学意义(P＜0.01)。3.RT-PCR结果显示,空白对照组、乙醛对照组、1.5 mmol/LSAM组、5.0 mmol/L SAM组Ⅰ型胶原mRNA的相对表达量分别为(x±s)：1.416±0.020、1.972±0.038、1.681±0.031、1.461±0.032；Ⅲ型胶原mRNA的相对表达量分别为(x±s)：0.996±0.008、1.875±0.028、1.537±0.056、1.053±0.062。与空白对照组比较,乙醛对照组Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA表达明显增强,差别有统计学意义(P0.01)。与乙醛对照组比较,1.5 mmol/L SAM干预组及5.0mmol/L SAM干预组Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA表达均明显减弱,差异有统计学意义(P＜0.01)。4. Western-blot结果显示,空白对照组、乙醛对照组、1.5 mmol/L组、5.0 mmol/L组Ⅰ型胶原的相对表达量分别为(x±s)：1.109±0.070、1.298±0.101、0.970±0.058、0.829±0.030；Ⅲ型胶原的相对表达量分别为(x±s)：1.017±0.013、1.204±0.024、1.089±0.015、1.048±0.019。与空白对照组比较,乙醛对照组Ⅰ型胶原蛋白表达明显增强,差别有统计学意义(P0.05)；Ⅲ型胶原蛋白表达显著增强,差别有统计学意义(P0.01)与乙醛对照组比较,1.5mmol/L SAM干预组及5.0 mmol/L SAM干预组Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白的表达均明显减弱,差异有统计学意义(P0.01)。结论：SAM在体外能有效抑制乙醛刺激的HSCs的增殖及Ⅰ型和Ⅲ型胶原合成,且抑制效果与SAM浓度呈现剂量依赖关系。本研究证实,SAM具有抗肝纤维作用,有可能用于预防和治疗酒精性肝病所导致的肝纤维化。
【学位授予单位】：泸州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R575.2
【图文】：

细胞的,生长状态,扁平形,对照组

醛对照组比较，SAM干预培养的各组细胞数目减少，细胞间的间隙增大，周边伪足减少，细胞呈短梭型或扁平形，并随着SAM浓度的升高，此变化更加明显。(见图2、3、4、5、6)。图2空白对照组HSC一T6细胞的生长状态 FigZGrowthofHSC一 T6eellsinstate ofeontrolgrouP图3乙醛对照组HSC一T6细胞的生长状态 Fig3GrowthofHSC一 T6eellsinstateof aeetaldehyde(AA)eontr01grouP

乙醛,细胞的,对照组,伪足

结果1倒置显微镜下观察细胞形态变化倒置显微镜下见空白对照组HSC一T6细胞生长良好，呈梭形或星形。与空白对照组比较，乙醛对照组细胞数目增多，排列密集，细胞间间隙更小，细胞周边伪足更多更长，胞体呈星形或不规则形。与乙醛对照组比较，SAM干预培养的各组细胞数目减少，细胞间的间隙增大，周边伪足减少，细胞呈短梭型或扁平形，并随着SAM浓度的升高，此变化更加明显。(见图2、3、4、5、6)。

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