卡维地洛对人肝星状细胞自噬与凋亡影响的研究

发布时间：2020-06-20 15:31

【摘要】：研究背景和目的:肝纤维化是各种急性或慢性肝脏损伤所导致的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在肝组织间质中过度沉积的病理学改变,是慢性肝病向肝纤维化、肝硬化进展的共同环节,抑制此环节的进展对预防肝纤维化的发生和进展有极为重要的意义。肝纤维化是一个极为复杂的病理过程,包含多个信号通路和细胞因子共同参与,但其确切机制尚未完全阐明。其中,位于肝脏“Disse隙”中的肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化、增殖、迁移、分泌细胞因子及ECM等特性是肝纤维化发生、发展的主要环节。非选择性β受体阻滞剂(Non-Selective Beta Blocker,NSBB),是肝硬化门静脉高压药物治疗的“基石”,可通过β1受体阻滞降低心脏输出量和β2受体阻滞收缩内脏血管,减少门静脉血流量,从而降低门静脉压力。普洛萘尔是第一个用于预防肝硬化食管胃静脉曲张出血的的NSBB,卡维地洛(Carvedilol)是第三代NSBB,具有较强的非选择性β受体阻滞作用和一定的α1受体阻滞作用。在传统NSBB作用基础上,卡维地洛的α1受体阻滞作用使得其不仅能减少心脏输出量及降低门静脉系统血流灌注量,同时还能降低肝内血管阻力。因此临床上卡维地洛较普萘洛尔具有更强的降低门静脉压力的作用。卡维地洛在肝脏中是否具有缓解纤维化作用,既往亦有多项类似的研究,以往研究提示卡维地洛具有抗鼠肝纤维化、抑制鼠HSC增殖及致纤维化作用,而HSC的活化、增殖、迁移等特性又是肝纤维化形成的中心环节,所以抑制HSC的活性有助于逆转肝纤维化。同时,自噬和凋亡在HSC的活化中起着重要作用,细胞自噬(autophagy)指真核细胞通过溶酶体降解细胞内错误产生的蛋白质和受损的细胞器来维持细胞稳定状态的过程,是细胞在应激时能自我修复的重要生理活动之一。当自噬被激活后,细胞将自身的受损细胞器和错误产生的蛋白质以自噬体的形成运送至溶酶体中发生酸性降解,使得细胞在营养匮乏时自我生成养料,提供能够维持自身新陈代谢的能量,是一种细胞的自我保护机制。细胞自噬和凋亡在HSC的活化过程中起着重要作用,增加HSC的凋亡或抑制其自噬可以显著降低其活力和活化状态。本研究旨在探究卡维地洛对于人肝星状细胞LX-2自噬和凋亡的影响,并探究其潜在抑制肝纤维化的机制。研究方法:1.体外培养人肝星状细胞系LX-2。2.Western blot验证卡维地洛对HSC表达自噬上游标志物(LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ、Beclinl、Atg5)的影响。3.透射电镜观察卡维地洛作用下HSC中的自噬泡的形态。4.应用相关自噬诱导剂和抑制剂使用细胞免疫荧光与Western blot验证卡维地洛对于自噬流的影响。5.应用相关自噬诱导剂和抑制剂使用细胞免疫荧光验证卡维地洛对于HSC中自噬体与溶酶体共定位的影响。6.应用相关自噬诱导剂和抑制剂使用细胞免疫荧光与Western blot验证卡维地洛对于HSC中溶酶体pH值的影响。7.Western blot、流式细胞技术与CCK-8实验验证卡维地洛对HSC活性与增殖的影响。8.Western blot验证卡维地洛对HSC凋亡相关信号通路蛋白cleaved-caspase8、cleaved-caspase3、cleaved-PARP、BAX和Bcl-2 的影响。9.应用相关自噬诱导剂和抑制剂使用Western blot与流式细胞技术探究卡维地洛作用下,HSC中自噬与凋亡的关系。研究结果:1.卡维地洛可增加HSC中LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ的转化,但不影响Beclinl、Atg5的表达。2.透射电镜显示卡维地洛用药组HSC中的自噬体数量明显高于对照组。3.相比于卡维地洛用药组,卡维地洛联合应用自噬早期抑制剂3-MA组HSC中自噬体数量明显减少,而卡维地洛联合应用自噬晚期抑制剂氯喹(CQ)组自噬体数量相比于卡维地洛组无统计学差异。4.卡维地洛可增加HSC中自噬下游标志物P62的表达,双标腺病毒GFP-RFP-LC3B转染显示应用卡维地洛后可增加HSC中自噬体的数量但无法增加自噬溶酶体的数量。5.单标腺病毒GFP-LC3B转染后显示卡维地洛并不影响自噬体与溶酶体的结合。6.卡维地洛可升高HSC中的pH值。7.卡维地洛能抑制HSC的增殖,并呈时间、剂量依赖性,12小时IC50=25.10μ M,24小时IC50=18.16 μM。8.卡维地洛可以增加 HSC 中 cleaved-caspase8、cleaved-caspase3、cleaved-PARP、BAX,减少Bcl-2的表达。9.卡维地洛作用6小时后HSC中自噬相关蛋白就已发生变化,但直到作用12小时后HSC中凋亡相关蛋白才发生变化。研究结论:卡维地洛可以抑制人HSC的自噬并促进人HSC的凋亡,卡维地洛对自噬的抑制作用早于其对凋亡的作用。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575.2

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本文编号：2722617