熊果酸对肝星状细胞NADPH氧化酶的亚基基因表达及酶活性的影响

发布时间：2020-06-25 02:08

【摘要】： 背景: 肝纤维化是各种原因引起慢性肝损伤后可逆性的创伤愈合反应,其持续进展的最终结局为肝硬化。因此,阻止和逆转肝纤维化具有重要的临床意义。近年来一些研究表明,肝星状细胞的NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)通过产生活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)介导了多种促肝纤维化因子在细胞内信号的转导,成为调控肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)纤维生成反应的信号传递枢纽。因此,通过调控NOX的活性和表达,可抑制ROS产生,干扰各种促肝纤维化因子在HSC内的信号转导,有望成为治疗肝纤维化的新靶点。熊果酸是存在于自然界的天然三萜类化合物,它是许多传统中药的主要成分。我们的前期研究发现熊果酸在体外能抑制HSC增殖和诱导其凋亡,体内能抑制DMN诱导的肝纤维化。但熊果酸对肝星状细胞NOX是否有影响及影响机制尚不清楚。 目的: 观察瘦素刺激HSC后细胞内ROS的来源,以及熊果酸对ROS产生的影响;观察熊果酸对NOX的亚基Rac1、P22PhoxmRNA表达以及对NOX活性的影响,探讨熊果酸影响肝星状细胞内ROS产生的机制。 方法: 1、为观察瘦素刺激HSC后细胞内ROS的来源及熊果酸对ROS产生的影响,取对数生长期的肝星状细胞(HSC-T6)随机分为13个组:瘦素组(100 ng/ml),熊果酸(50uM)干预组、NAC(10mM)干预组、DPI(20uM)干预组、AG490(50uM)干预组、鱼藤酮(20uM)干预组、2-双(3-吡啶)1-丙酮(250 uM)干预组、别嘌呤醇(100uM)干预组、吲哚美辛(100uM)干预组、熊果酸(50uM)自身对照组、Rosup(5ug/ml)阳性对照组、正常对照组和空白照组。按实验步骤选择不同的药物作用HSC 1h、12h或24h后,采用流式细胞术检测DCF荧光强度来观察细胞内ROS的水平。 2、为观察熊果酸对肝星状细胞NOX的亚基Rac1、P22PhoxmRNA表达以及对NOX活性的影响,取对数生长期的肝星状细胞(HSC-T6)随机分为7组:瘦素组(100 ng/ml),熊果酸(50uM)干预组、NAC(10mM)干预组、DPI(20uM)干预组、AG490(50uM)干预组、熊果酸(50uM)自身对照组和正常对照组。在药物作用HSC 6h、12h或24h后,提取总RNA,采用RT-PCR检测NOX亚基Rac1、p22Phox mRNA的表达;同样在药物作用HSC 6h、12h或24h后,加入250μmol/l的NADPH孵育,通过分光光度计观察NADPH的消耗量来分析NOX的活性。 结果: 1、正常对照组的DCF荧光强度比空白对照组高(P0.01),但明显低于Rosup阳性对照组(P0.01);瘦素组较正常对照组的DCF荧光强度明显增高(P0.01),与Rosup阳性对照组相比无明显差异(P0.05);DPI干预组的DCF荧光强度较瘦素组及Rosup阳性对照组明显降低(P0.01),与正常对照组无明显差异(P0.05);鱼藤酮干预组、2-双(3-吡啶)1-丙酮干预组、别嘌呤醇干预组及吲哚美辛干预组的DCF荧光强度较正常对照组明显增高(P0.01),与瘦素组及Rosup阳性对照组相比无明显差异(P0.05);AG490干预组的DCF荧光强度较瘦素组及Rosup阳性对照组明显降低(P0.01),但较DPI干预组及正常对照组高(P0.05,P0.01)。 2、熊果酸干预组及熊果酸自身对照组1h的DCF荧光强度较瘦素组及Rosup阳性对照组明显为低(P0.01),但较正常对照组高(P0.01);熊果酸干预组12h、24h的DCF荧光强度不但比瘦素组低(P0.01),而且12h的DCF荧光强度较1h低(P0.01),24h的DCF荧光强度又较12h低(P0.01),在24h与DPI干预组无明显差别(P0.05);NAC干预组的DCF荧光强度明显低于瘦素组及Rosup阳性对照组(P0.01),但NAC12h、24h的DCF荧光强度较1h明显为高(P0.01)。 3、瘦素组6h、12h、24h的Rac1mRNA较正常对照组的表达明显升高(P0.01),其中又以12h表达水平最高;熊果酸干预组及熊果酸自身对照组6h、12h、24h的Rac1mRNA表达较瘦素组明显为低(P0.01),与正常对照组的表达无明显差别(P0.05);NAC干预组、DPI干预组、AG490干预组6h、12h、24h的Rac1mRNA与瘦素组的表达无明显差别(P0.05),而且NAC干预组、DPI干预组、AG490干预组12h的Rac1mRNA的表达明显高于正常对照组(P0.01),DPI干预组、AG490干预组24h的Rac1mRNA表达高于正常对照组(P0.01,P0.05)。 4、瘦素组6h、12h、24h的p22Phox mRNA较正常对照组的表达明显升高(P0.01);熊果酸干预组及熊果酸自身对照组6h、12h、24h的p22PhoxmRNA表达较瘦素组明显为低(P0.01),与正常对照组的表达无明显差别(P0.05);NAC干预组6h的p22PhoxmRNA较正常对照组的表达明显高(P0.01),但24h的p22PhoxmRNA表达较瘦素组低(P0.01);DPI干预组6h和24h的p22PhoxmRNA表达较瘦素组低(P0.01,P0.05);AG490干预组6h、12h的p22PhoxmRNA较正常对照组的表达高(P0.01,P0.05)。 5、瘦素组6h、12h、24h的肝星状细胞NOX活性均较正常对照组明显增高(P0.01);DPI干预组、AG490干预组6h、12h、24h的NOX活性均明显低于瘦素组(P0.01);熊果酸干预组6h、12h、24h的NOX活性较瘦素组明显为低(P0.01),且与DPI干预组无明显差别(P0.05);NAC干预组6h、12h、24h的NOX活性高于正常对照组(P0.01),与瘦素组相比无明显差别(P0.05)。 结论: 1、瘦素能刺激HSC产生ROS,其机制可能是通过JAK信号通路激活NOX,及(或)通过诱导NOX的亚基表达使NOX活性增加而产生ROS。 2、熊果酸干预后能明显抑制瘦素诱导的HSC内ROS的产生,并能抑制NOX亚基Rac1和p22Phox的mRNA表达及NOX活性,推测熊果酸可能通过抑制NOX亚基表达进而抑制NOX活性,使ROS产生减少。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R575.2
【图文】：

瘦素刺激HSC1小时流式细胞仪检测的DCF荧光强度

附图 2 不同 ROS 生成系统的抑制剂干预 1 小时流式细胞仪检测的 DCF 荧光强度A（瘦素组），D（DPI 干预组），G（正常对照组），H（ROT 干预组），I（MET 干预组），J（ALL 干预组），K（IND 干预组），M（Rosup 阳性对照组）。36

【参考文献】

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本文编号：2728702