溃疡性结肠炎及回肠贮袋肠道微生物屏障的实验研究

发布时间：2017-03-29 03:14

  本文关键词：溃疡性结肠炎及回肠贮袋肠道微生物屏障的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:分析溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)及全结直肠切除、回肠贮袋肛管吻合手术(ileal pouch anal anastomosis,IPAA)术后回肠贮袋的肠道微生物屏障变化,探讨UC及回肠贮袋炎发生的微生物学机制。方法:收集2013年7月~2014年7月在天津医科大学总医院普通外科和消化内科病房及门诊的UC患者和IPAA术后患者粪便标本,同时收集性别年龄相匹配的健康人粪便标本作为健康对照组。按照评估UC活动性的改良Mayo评分系统将UC组分为缓解期、轻度活动、中度活动及重度活动四组,按照回肠贮袋炎活动指数评分(PDAI)将IPAA术后组分为7分(无贮袋炎组)和7分及以上(贮袋炎组)两组。采用粪便基因组DNA提取试剂盒提取粪便基因组DNA,设计带有GC片段的针对细菌16Sr DNA基因V3区通用引物,采用Touchdown PCR技术对粪便基因组DNA进行扩增,将扩增后的PCR产物进行变性梯度凝胶电泳(DGGE),对DGGE条带进行切胶、回收、测序,确定各条带所代表的细菌种类。对DGGE条带进行多样性分析,采用quantity one软件对健康对照组、UC各组及IPAA术后各组进行Dice相似性分析及UPGMA树状图分析,采用Canoco软件对健康对照组、UC各组及IPAA术后各组进行主成份分析(PCA分析)。结果:健康对照组:健康人肠道菌群的16Sr DNA基因V3区的DGGE图谱主要由16.63±2.872条优势条带(优势菌群)组成;健康人肠道主要优势菌属以普氏菌属为代表的各种拟杆菌为主。UC各组:与健康对照组相比,UC患者肠道细菌多样性减少,且随病情加重而明显,差异具有统计学意义(p0.05);与健康对照组相比,UC患者肠道优势菌属种类分布发生变化,主要表现为有益菌或中性菌如普氏菌属等的减少和有害菌如致病性大肠杆菌等的增加;Dice相似性分析及UPGMA树状图分析均表明,健康对照组与UC各组组间相似性低于组内相似性(p0.05);PCA分析显示,前两个排序轴对物种变量的解释量为40.3%,不同组别之间能够被理想的分开。IPAA术后各组:与健康对照组相比,IPAA术后患者回肠贮袋细菌多样性减少,且随PDAI评分增加而明显,差异具有统计学意义(p0.05);与健康对照组相比,IPAA术后患者肠道优势菌属种类分布及数量发生变化;Dice相似性分析及UPGMA树状图分析均表明,健康对照组与IPAA术后各组组内相似性大于组间相似性(p0.05);PCA分析表明,前两个排序轴对物种变量的解释量为40.0%,正常对照组、无贮袋炎组和贮袋炎组能够被理想的分开。结论:肠道菌群组成复杂,个体差异较为明显,肠道菌群的复杂程度也代表了肠道微生物屏障的复杂性。溃疡性结肠炎患者肠道菌群种类和数量发生明显改变,并随病情加重而明显,且相同组内的菌群改变存在一定的趋势。本实验成果的取得对临床上应用益生菌、抗生素及粪菌移植等治疗UC提供依据,也为下一步采用特异性菌群进行动物灌肠及UC动物模型构建奠定了坚实的基础。IPAA术后回肠贮袋正常菌群发生改变,回肠贮袋炎患者贮袋正常菌群发生紊乱。肠道及回肠贮袋菌群失调与肠粘膜及回肠贮袋粘膜相互作用,直接或间接地的影响肠道微生物及免疫系统,导致肠粘膜及贮袋粘膜微生物屏障损伤,介导了溃疡性结肠炎及回肠贮袋炎的发生及发展。
【关键词】：溃疡性结肠炎 外科手术 贮袋炎 肠道菌群 发病机制
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R574.62
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语/符号说明10-11
• 前言11-14
• 研究现状、成果11-13
• 研究目的、方法13-14
• 1.材料与方法14-26
• 1.1 实验材料14-16
• 1.1.1 实验对象14
• 1.1.2 主要试剂及配制14-16
• 1.1.3 主要仪器16
• 1.2 实验分组16-18
• 1.2.1 实验分组设计16-17
• 1.2.2 分组依据17-18
• 1.3 实验方法18-26
• 1.3.1 粪便基因组DNA的提取18-20
• 1.3.2 基因组DNA浓度及纯度检测20
• 1.3.3 细菌基因组 16SrDNA V3区特异性扩增20-23
• 1.3.4 对Touchdown PCR产物的DGGE电泳检测23-25
• 1.3.5 实验数据的统计25-26
• 2.结果26-42
• 2.1 临床资料26-27
• 2.2 粪便基因组DNA的提取鉴定27-28
• 2.3 Touchdown PCR产物鉴定28-29
• 2.4 DGGE图谱解读29
• 2.5 DGGE重现性鉴定29-30
• 2.6 DGGE条带回收测序结果30-31
• 2.7 健康对照组DGGE图谱分析31-32
• 2.8 UC各组DGGE图谱分析32-38
• 2.8.1 健康对照组与UC各组细菌多样性分析32-34
• 2.8.2 健康对照组与UC各组Dice相似性及UPGMA树状图分析34-36
• 2.8.3 健康对照组与UC各组主成份分析36-38
• 2.9 IPAA术后各组DGGE图谱分析38-42
• 2.9.1 健康对照组与IPAA术后各组细菌多样性分析38-39
• 2.9.2 健康对照组与IPAA术后各组Dice相似性及UPGMA树状图分析39-40
• 2.9.3 健康对照组与IPAA术后各组主成份分析40-42
• 3.讨论42-51
• 3.1 肠道屏障42-46
• 3.1.1 肠道屏障的组成及特点42-44
• 3.1.2 溃疡性结肠炎肠道微生物屏障44-45
• 3.1.3 IPAA术后贮袋微生物屏障45-46
• 3.2 16SrDNA-PCR-DGGE技术46-48
• 3.2.1 16SrDNA遗传信息46-47
• 3.2.2 DGGE技术47-48
• 3.3 实验结果讨论48-51
• 不足和展望51-52
• 结论52-53
• 参考文献53-57
• 发表论文和参加科研情况说明57-58
• 综述 溃疡性结肠炎发病机制的研究进展58-69
• 综述参考文献63-69
• 致谢69

【共引文献】

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