高脂饮食诱导幼年和成年小鼠非酒精性脂肪性肝病的研究

发布时间：2020-07-01 22:35

【摘要】：背景和目的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是最常见的慢性肝病之一,在全球范围内的平均患病率为26%。随着人们饮食结构和生活方式的改变,NAFLD呈现出低龄化趋势,且在肥胖或胰岛素抵抗人群中更为普遍,现已成为儿童和青少年慢性肝脏疾病最常见的原因。流行病学研究发现,NAFLD在我国中重度肥胖青少年中的发病率达30.14-49.85%。肥胖、糖尿病和NAFLD等代谢性疾病的广泛流行给人们带来了严峻的挑战。高脂饮食诱导的NAFLD小鼠模型与人类疾病进展的因果关系密切,是NAFLD病理研究中应用最为广泛的模型。本研究通过建立NAFLD小鼠模型,检测其体重、生化指标及肝脏病理学改变,动态观察高脂饮食诱导下幼年和成年小鼠NAFLD发生发展的演变过程:通过基因表达谱芯片检测小鼠肝脏脂代相关基因的mRNA表达,探究脂代谢异常与幼年小鼠早期脂肪肝发病的关系;通过RT-PCR进一步检测炎症相关基因的mRNA表达,探讨炎症反应参与幼年和成年小鼠NAFLD的潜在机制,为NAFLD发病机制的研究及治疗提供理论依据和研究平台。方法1.6周龄野生型C57BL/6J小鼠,雌性20只,雄性5只。适应性喂2周后,将8周龄雌性小鼠与雄性小鼠合笼交配。断乳后(3周龄)的雄性小鼠为实验对象,随机分为以下3组:(1)HF-Y组(高脂饮食幼年组):小鼠3周龄断乳后给予高脂饮食(40%脂肪,2%果糖,2%胆固醇);(2)HF-A组(高脂饮食成年组):小鼠断乳后正常饮食(10%脂肪)喂养至8周龄后给予高脂饮食:(3)NC组(正常饮食组):小鼠断乳后给予正常饮食,并持续喂养至实验终点。2.每周监测小鼠的体重,分别于高脂饮食喂养的2、4、12、16、20和25周进行心脏取血后处死小鼠,留取肝脏标本。利用全自动生化分析仪检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)。利用胆固醇荧光测定试剂盒检测总胆固醇(TC),甘油三酯比色测定试剂盒测定甘油三酯(TG)。禁食10小时后,行腹腔注射葡萄糖耐量试验(IPGTT),尾静脉取血测定小鼠血糖。3.处死小鼠后立即取出肝脏,液氮速冻,-80 ℃保存。经过固定液固定,石蜡包埋,切片,苏木精-伊红(HE)染色法观察肝脏组织形态。CD45抗体、F4/80抗体和Collagen 1 alpha 1抗体的免疫组化染色评价小鼠肝脏炎症和纤维化。4.分别取高脂喂养0和2周的HF-Y组和HF-A组肝脏标本,基因表达谱芯片检测肝脏中脂代谢相关基因的表达,具体包括:ATP结合盒亚族A成员1(ABCA1)、ATP结合盒子亚族G成员(ABCG1)、乙酰辅酶A乙酰转移酶(ACAT1)、甾醇O-酰基转移酶2(SOAT2)、极长链特异性酰基辅酶A脱氢酶(ACADVL)、脂肪分化相关蛋白(ADFP)、载脂蛋白E(APOE)、花生四烯酸12-脂氧合酶(ALOX12)、花生四烯酸15-脂氧合酶(ALOX15)、花生四烯酸5-脂氧合酶(ALOX5)、花生四烯酸5-脂氧合酶激活蛋白(ALOX5AP)、血小板糖蛋白4(CD36)、固醇26-羟化酶(CYP27A1)、脂肪酸结合蛋白4(FABP4)、脂肪酸结合蛋白5(FABP5)、脂肪酸去饱和酶1(FADS1)、脂肪酸去饱和酶2(FADS2)、脂肪酸去饱和酶3(FADS3)、甘油激酶(GYK)、3-羟-3甲基戊二酰-CoA还原酶(HMGCR)、3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A合酶(HMGCS1)、线粒体三功能酶β亚基(HADHB)、胰岛素诱导基因1(INSIG1)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、低密度脂蛋白(LDLR)、白三烯A4水解酶(LTA4H)、白三烯C4合成酶(LTC4S)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、羟甾醇受体LXRα(NR1H3)、细胞溶质磷脂酶A2(PLA2G4A)、过氧化物酶增殖激活受体δ(PPARD)、过氧化物酶体增生激活受体γ(PPARG)、前列腺素G/H合成酶2(PTGS2)、单羧酸转运蛋白7(SLC16A6)、长链脂肪酸转运蛋白1(SLC27A1)、长链脂肪酸转运蛋白3(SLC27A3)、固醇调控元件结合转录因子1(SREBF1)、固醇调控元件结合转录因子2(SREBF2)、类固醇激素合成急性调节蛋白相关脂质转移蛋白4(STARD4)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)、血栓素A合成酶(TBXAS1)、肿瘤坏死因子(TNF)、解偶联蛋白2(UCP2)的mRNA表达。RT-PCR重复验证基因表达谱芯片扩增结果较好的基因。5.分别取高脂饮食喂养16和20周的HF-Y组和HF-A组肝脏标本,RT-PCR检测肝脏中炎症相关基因的表达,具体包括:白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-α(INF-α)、干扰素-β(INF-β)的mRNA表达。结果1.体重:0-4周,HF-Y组体重增长速率高于HF-A组;4周后,HF-Y组体重增长速率减低,与HF-A组基本一致。3-13周,同周龄的HF-Y组体重高于HF-A组;13-25周,同周龄的HF-A组体重高于HF-Y组。相同周龄下,HF-Y组和HF-A组体重高于NC组(P0.05)。2.肝功能:2周,HF-Y组ALT显著高于HF-A组(P0.05)。4周,HF-Y组ALT较2周时明显降低,与HF-A组基本一致。4周后,两组ALT水平逐渐升高:25周,HF-A组ALT显著高于HF-Y组(P0.05)。0-12周,HF-A组和HF-Y组AST无显著差异(P0.05);16周,HF-A组AST显著高于HF-Y组(P0.05);20周起,与HF-Y组相比,HF-A组AST有升高趋势,但差异不具有统计学意义(P0.05)。3.血脂:2周,HF-Y组TG显著高于HF-A组(P0.05)。4周,与HF-A组相比,HF-Y组TG有升高趋势,但差异不具有统计学意义(P0.05)。12-25周,HF-Y组和HF-A组TG无显著差异(P0.05)。0-16周,HF-A组和HF-Y组TC无显著差异(P0.05)。20周,两组TC较16周显著升高;与HF-Y组相比,HF-A组TC有升高趋势,但差异不具有统计学意义(P0.05)。4.IPGTT:20周,糖耐量结果显示,HF-Y组和HF-A组各时间点血糖显著高于NC组(P0.05)。HF-Y和HF-A组糖耐量曲线下面积(AUC)显著高于NC组(P0.05)。与HF-Y组相比,HF-A组AUC有升高趋势,但差异不具有统计学意义(P0.05)。5.肝脏病理结果:2周,HF-Y组肝脏较0周发生明显脂肪变性。4周,HF-Y组肝脏脂肪浸润改善,与HF-A组肝脏脂肪变性程度基本一致。16和20周,两组肝脏均呈现弥漫性脂变;与HF-Y组相比,HF-A组出现严重的大泡型脂肪变,伴炎症浸润和纤维化。6.脂代谢相关基因表达结果:高脂饮食喂养2周,与HF-A组相比,HF-Y组LPL、FABP5、UCP2、TBXAS1的mRNA表达上调(P0.05),ALOX12的mRNA表达下调(P0.05)。7.炎症相关基因表达结果:与HF-A组相比,高脂饮食喂养16周,HF-Y组TNF-α的mRNA表达下调(P0.05);高脂饮食喂养20周,HF-Y组IL-6和TNF-α的mRNA表达下调(P0.05)。结论1.幼年小鼠高脂饮食初期生长迅速,伴发脂肪肝;至喂养中后期,对慢性脂质应激的耐受性增强。成年小鼠早期NAFLD进展缓慢;至喂养中后期,脂肪肝较幼年小鼠更为严重。2.LPL、FABP5、UCP2、TBXAS1和ALOX12等脂代谢相关基因可能参与幼年小鼠NAFLD的早期发病。3.幼年小鼠脂肪性肝炎进展缓慢可能与炎症相关基因IL-6和TNF-α的表达减低有关。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575.5
【图文】：

体重,周龄,年龄

图３．１．丨ＨＦ－Ｙ组和ＨＦ－Ａ组体重随ＨＦＤ时间的变化逡逑年龄下比较各组小鼠体重：与ＮＣ组相比，ＨＦ－Ｙ组和丨丨Ｆ－Ａ组生长周，同周龄的ＨＦ－Ｙ组体重高于ＨＦ－Ａ组；１３－２５周，同周龄的ＨＦ于ＨＦ－Ｙ组（尸＜０．０５）（图３．１．２）。逡逑４５－１逡逑｜邋Ｉ逡逑Ｉ逦：邋ｒ逡逑ｌｏ－ｊ逡逑＾逦４邋６邋８邋１０邋１２邋１４邋１６邋１８邋２０邋２２邋２４逡逑Ａｇｅ邋（ｗｅｅｋｓ）逡逑图３．１．２各组体承随年龄的变化逡逑功能逡逑

年龄,周龄,体重,生化指标

第一部分ＮＡＦＬＤ小鼠体重，生化指标及肝脏病理改变５０－１逡逑－５＊逦１５－邋＾逦＋邋ＨＦ－Ａ逡逑Ｍ逦１０－＾逦■０？邋ＨＦ－Ｙ逡逑５－逡逑０邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋１邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ逡逑０邋２邋４邋６邋８邋１０邋１２邋１４邋１６邋１８２０邋２２邋２４逡逑Ｔｉｍｅ邋（Ｗｅｅｋｓ）逡逑图３．１．丨ＨＦ－Ｙ组和ＨＦ－Ａ组体重随ＨＦＤ时间的变化逡逑同年龄下比较各组小鼠体重：与ＮＣ组相比，ＨＦ－Ｙ组和丨丨Ｆ－Ａ组生长３周，同周龄的ＨＦ－Ｙ组体重高于ＨＦ－Ａ组；１３－２５周，同周龄的ＨＦ－高于ＨＦ－Ｙ组（尸＜０．０５）（图３．１．２）。逡逑４５－１逡逑

【相似文献】