BTLA在MHV-3诱导的暴发性肝炎中的免疫调节作用及机制研究

发布时间：2020-07-02 04:28

【摘要】：暴发性病毒肝炎（Fulminant viral hepatitis，FH)是病毒感染引起的大规模肝细胞坏死，严重的肝功能损害、肝性脑病等为特征的临床综合症。常见于中国及其他HBV流行的亚洲国家，起病急，死亡率高，缺乏有效的治疗手段。寻找有效的治疗手段需要我们对其致病机制有更进一步的认识，对MHV-3诱导的暴发性肝炎模型的研究将有利于我们更进一步的认识暴发性肝炎的发病机制，为暴发性肝炎的临床治疗提供新的理论依据。 MHV-3是冠状病毒科的单正链RNA病毒，敏感小鼠如Balb/c、C57/BL感染可在肝血窦形成血栓，致肝脏微循环改变，大量肝细胞缺血坏死，引起暴发性病毒肝炎且3-7天死亡，而A/J等耐受小鼠则对其完全耐受，不表现出任何临床症状。敏感小鼠感染MHV-3后，单核巨噬细胞活化表达凝血酶原酶纤维介素（Fibrinogen like protein2/fibroleukin, FGL2），裂解凝血酶原为有活性的凝血酶，启动凝血级联反应，引起纤维蛋白沉积，血管内凝血，肝血窦血栓形成，肝细胞坏死。 B、T淋巴细胞衰减子（B and T lymphocyte attenuator，BTLA）是新近鉴定的具有抑制T细胞活化增殖的CD28免疫球蛋白超家族成员。BTLA与其配体疱疹病毒侵入受体（herpes virus entry mediator，HVEM）结合后可以抑制CMV特异的CD8+T细胞的活化增殖以及IL-2的分泌，在免疫应答的负性调节以及外周免疫耐受中发挥重要的作用。BTLA参与多种疾病的发生发展，如BTLA-/-小鼠对实验性自身免疫性脑炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)，过敏性呼吸道炎症以及自身免疫性肝炎等较WT小鼠更为敏感。BTLA在感染疾病中同样发挥了重要作用，CMV感染中，BTLA在CMV特异的CD8+T细胞上高表达，阻断BTLA信号，可增强CMV特异的CD8+T细胞的增殖，说明BTLA可抑制病毒特异性的CTL反应。对寄生虫感染的研究发现，阻断BTLA信号，可以加快机体对李斯特杆菌的清除。在我们的前期工作中发现，PD-1可以减轻MHV-3诱导的肝损伤。与WT小鼠相比，PD-1-/-小鼠MHV-3感染后肝脏病变更严重，死亡率更高，提示CD28家族成员参与了MHV-3诱导的暴发性肝炎。目前为止，BTLA在MHV-3诱导的暴发性肝炎还未知。 为明确BTLA在MHV-3诱导的暴发肝炎中的作用，我们以BTLA-/-和WT小鼠为研究对象，腹腔感染MHV-3后，比较两组小鼠的生存曲线，肝脏病理，血清ALT、AST、FGL2。结果发现WT小鼠在感染后9天内全部死亡，而BTLA-/-小鼠在感染后20天仍有87.5%(7/8)的存活。HE染色发现感染后48hWT小鼠即有严重的肝细胞、脾细胞坏死，到72h更剧，而同时相的BTLA-/-小鼠肝脏、脾脏细胞均较正常。与HE结果一致，TUNEL分析可见WT小鼠大量肝细胞、脾细胞凋亡，而BTLA-/-凋亡较少。BTLA-/-小鼠血清ALT、AST显著性低于感染后同时相WT小鼠。免疫双荧光分析发现FGL2表达于CK18+的上皮细胞，F4/80+的巨噬细胞，CD11C+的DC细胞和CD31+的内皮细胞，少量表达于CD3+T细胞。BTLA-/-小鼠感染MHV-3后，血清FGL2显著性低于WT小鼠；肝脏fgl2mRNA水平明显低于WT小鼠；与mRNA一致，肝脏FGL2也明显较WT少，纤维蛋白沉积也较少。本部分实验结果提示，BTLA不是减弱，而是促进了MHV-3诱导的暴发性肝炎。BTLA基因敲除后可使小鼠FGL2表达显著性降低，纤维素沉积减少，肝脏病理减轻，使MHV-3诱导的暴发性肝炎致死率降低。 为进一步明确BTLA促进MHV-3诱导的暴发性肝炎的作用机制，首先免疫荧光分析BTLA在器官中的表达，发现在肝脏、脾脏、淋巴结均有BTLA阳性细胞。流式分析发现MHV-3感染后，BTLA在CD4+T、CD8+T、B细胞上表达下调，而在巨噬细胞上显著性上调。BTLA-/-和WT小鼠巨噬细胞表达相当量的共刺激分子，凋亡相关分子以及促炎细胞因子。MHV-3感染后，Annex-V/PI染色发现，BTLA-/-小鼠巨噬细胞的凋亡显著性高于WT小鼠，进而BTLA-/-小鼠MHV-3感染24h，腹腔巨噬细胞，肝脏巨噬细胞频率明显低于WT小鼠；巨噬细胞体外感染MHV-3，TUNEL分析其凋亡也发现BTLA-/-小鼠巨噬细胞凋亡明显高于WT巨噬细胞。本部分实验结果提示，巨噬细胞上BTLA的表达维持了其存活，BTLA基因敲除后，MHV-3感染可导致巨噬细胞的凋亡增加，炎症反应减轻，FGL2分泌减少，进而保护小鼠的肝脏免受损伤，提高了其生存率。 为明确巨噬细胞凋亡是否会导致炎症因子的减少。我们以RT-PCR方法分析BTLA-/-和WT小鼠MHV-3感染后肝脏炎症因子的mRNA，发现肝脏中TNF-α mRNA显著性低于WT小鼠，而其他细胞因子，如IL-2、IL-4等变化不明显。流式分析巨噬细胞单个水平TNF-α分泌情况，结果显示BTLA-/-小鼠巨噬细胞TNF-α分泌显著性高于WT小鼠，但由于BTLA-/-小鼠巨噬细胞凋亡显著性高于WT小鼠，因此BTLA-/-小鼠血清TNF-α水平却显著性低于WT小鼠。MHV-3感染后，给BTLA-/-小鼠体内补充TNF-α重组蛋白，可使肝脏病变加重，血清ALT、AST、FGL2显著增高，死亡率增高。TNF-α-/-小鼠感染MHV-3后，其死亡率、肝脏病变以及血清ALT、AST、FGL2等显著性低于其野生型。这些结果表明，TNF-α在BTLA促进MHV-3诱导的暴发性肝炎中发挥了非常重要的作用，BTLA基因敲除后，MHV-3感染所致的巨噬细胞大量凋亡，导致体内TNF-α显著性降低，FGL2分泌减少，肝脏病变减轻，死亡率减少。 为进一步明确巨噬细胞上BTLA分子的缺失是导致BTLA-/-小鼠对MHV-3耐受的主要原因，我们分选WT小鼠腹腔巨噬细胞，过继回输给感染了MHV-3的BTLA-/-小鼠，结果发现小鼠的死亡率明显增高。WT小鼠感染MHV-3后，体内阻断BTLA信号，可使小鼠的存活时间明显延长，死亡率明显减少。 综上，在MHV-3诱导的暴发性肝炎中，BTLA通过调节巨噬细胞的存活，进而影响了肝脏病变的严重程度，小鼠的致死率。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R575.1
【图文】：

图1-1：H&E分析肝脏病理，免疫组化分析肝组织中FGL2表达及纤维蛋白沉积情况。HBV-ACLF患者肝细胞坏死严重，大量CD68+细胞浸润，FGL2表达及纤维蛋白沉积。Fig1-1：The morphology of liver biopsy from FH patients with HBV-ACLP, mild CHB and normalhealth was compared by H&E staining, and the expression of CD68 , FGL2 as well as Fibrinogendeposits was detected by immunohistochemistry.18

BTLA的表达，15例慢性乙型肝炎患者肝脏中有2例检测出BTLA表达，其余没有检测到BTLA的表达，然而在HBV-ACLF患者中，3例肝组织均检测到大量BTLA的表达，图1-2。图 1-2：免疫组化分析肝组织中 BTLA 表达。HBV-ACLF 肝组织中 BTLA 大量表达，而只有 2 例（共 15 例）慢乙肝患者肝组织中检测出 BTLA，正常人肝组织中未检出。Fig1-2：Immunohistochemistry showed that the expression of BTLA (A) was absence in normal healthliver tissues. (B) Very rare BTLA+cells were observed in mild CHB. (C) The expression of BTLA oninflammatory cell-like cells, (D) macrophage-like cells,(E) and benign bile ducts were observed in livertissues of HBV-ACLP. (F) Mouse IgG1 isotype control.三、 BTLA主要表达于CD68+细胞为更进一步明确BTLA的表达特征，我们通过免疫双荧光染色分子BTLA与CD68、CD3、FGL2、CD31、CK18的共聚。结果如图1-3所示，BTLA主要表达于肝组织中CD68+巨噬细胞、CK18的上皮细胞上，与FGL2共表达，而在CD3T细胞及CD31内皮细胞几乎无表达。19

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本文编号：2737742