乙醛对体外培养的大鼠肝星状细胞的促纤维化作用及复方中药的干预作用

发布时间：2020-07-04 06:16

【摘要】： 前言 肝硬化是威胁人类健康的严重疾病，肝纤维化是各种肝病(包括病毒性、酒精性、化学性等)发展成肝硬化的必经之路。肝纤维化的发展是细胞外基质(ECM)合成增加、降解减少的结果。肝星状细胞(HSC)的活化是肝纤维化发生的中心环节，HSC是分泌合成胶原的主要细胞。在ECM降解过程中起主要作用的酶类是基质金属蛋白酶(MMPs)及其抑制剂(TIMPs)和尿激酶原激活系统(uPA和PAI-1)。HSC激活受多种细胞因子的调控如肿瘤坏死因子(TNF-α)、转化生长因子β_1(TGF-β_1)、血小板源性生长因子(PDGF)等，其中PDGF是最强的促有丝分裂原，TGF-β_1为最强的促肝纤维化因子。目前普遍认为，在酒精性肝纤维化和肝硬化形成过程中，HSC起重要作用，HSC体外培养成功为肝纤维化的研究提供了理想的细胞模型。中药复方的多途径、多层次、多靶点的综合药理作用在抗肝纤维化治疗中显示出独特的优势。本研究观察了中药抗纤复方Ⅰ号(KXI)对乙醛处理的体外培养的大鼠HSC增殖、胶原合成、MMPs、TIMPs及PAI-1mRNA的表达和TGF-β_1、PDGF分泌的影响，以期阐述KXI抗酒精性肝纤维化的作用机制，为临床酒精性肝病(ALD)的中药治疗提供更多的理论依据。 材料与方法 一、主要材料与仪器 (一)动物为Wistar雄性大鼠。Ⅳ型胶原酶、密度梯度离心介质Nycodenz、NP-40均为Sigma公司产品，链霉蛋白酶为德国Merck公司产品，四 甲基偶氮哩蓝（M’IT）为Fluka公司产品，40％乙酸（分析纯）购自中国医药 集团上海化学试剂公司，DMEM培养液为美国GeO公司产品。兔抗人结 蛋白（Deslnin）抗体、SP组化试剂盒购于福建迈新公司，PClll、LN、HA放射 免疫测定试剂盒为上海海军医学研究所产品；RT－PCR试剂盒为hkaa产 品，引物均由北京奥科公司合成。双抗体夹心ABC－EllSA试剂盒购于上 海森雄科技实业有限公司。 （二）药物与药物血清的制备：抗纤复方互号（主要由丹参、黄茂、红花。 汉防己、葛根、桃仁、甘草等药物组成）浓缩口服制剂和生理盐水，给大鼠谁 服。无菌条件下由下腔静脉取血，离心取血清。使用时用无血清 DMEM培 养液稀释成10％的药物和正常血清孵育液。 （三）酶标仪E－Uza Mat－300：美国产JC－12ho放射免疫Y顺仪： 中国产；w’n－100 PCR扩增仪：美国产；ID Kodak成像分析系统：美国产； 稳压电泳仪 POWER／NPACJ00：BIO－RAD产品。 二、方法 （一）肝星状细胞分离、培养和鉴定 参照宋少刚等报道的方法分离肝星状细胞。采用链霉蛋白酶及IV型 胶原酶对大鼠肝脏进行原位灌流消化，经比扬他以d用E密度梯度离心，吸 取界面处的细胞悬浮于20％小牛血清DMEM培养液中，以IX10VInl的浓 度接种在塑料培养M里，置CO。培养箱中培养。本次实验采用传2－4代 HSC。HSC鉴定方法：将细胞爬片用兔抗人Desndn抗体、SP法作免疫细胞 化学染色，胞浆阳染者为HSC。 （二）细胞增殖率测定 采用Mrt比色法，传代的细胞长满单层后用胰酶消化后置20％小牛血 清 DMEM培养液中，调整细胞数为 IX10＊L，以每孔 100gi加人96孔培养 板内，置 CO。培养箱内预培养72h后，分成正常血清对照组、正常血清十乙 醛组及药物血清十乙醛组。每孔100J10％药物血清孵育液，再加人乙醛 使之终浓度分别为 100w上00uM300uM。对照血清十乙酸组以同样方法 添加正常血清及乙醛。每个浓度设4个复孔，作用 24b后，加人 W液 20叶，用酶标仪测其OD值。 （三）放免法测定nlll、LN、HA含量 以 IX10＊瓶浓度接种在培养瓶（25Cm2）中的 HSC长满单层后，分为正 ·2· 常血清对照组、正常血清十乙醛组及药物血清十乙醛组。乙醛组加人乙醛 后使终浓度为二见刚，血清浓度为10％，培养24h后收集培养上清，每个样 品作双复管，严格按说明操作。JC－1200放射免疫Y计数仪上直接测定 PClll、LN、HA含量，取均值。 （四）ELISA法检测TGF ＊；和PDGF含量 按方法（三）处理HSC及收集培养上清，每个样品均作复管，严格按说 明操作。酶标仪检测OD值。 （五）RT一PCR检测al（I）、al（IV）型胶原，MMP一1、2、9，TIMP一1、2 和 PAI人 表达 按方法（三）处理HSC 6h和24h，分另提取总RNA并测定RNA浓度和 纯度。2 pgRNA经 BcaBEST Polylnerase逆转录成 cDNA。引物参照文献设 计，p－achn作为内参照，PCR扩增条件及产物各有不同（详见论文部分人 PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳、摄片、密度扫描，然后用其表达量与对应 p－achn的表达量进行比较。 （六）统计学处理 各组数据以均值上标准差k。S）表示，两两均数的比较用t检验。 实验结果 （一）培养大鼠HSCS的鉴定 免疫细胞化学染色显示，传代＊SC纯度＞98％。（见图1－1） （二）乙醛及药物血清对HSC增殖的影响 正常血清浓度为10％时，乙醛浓度为100pM在00pMJ00pM时均对 ＊SC有增殖作用汗＜o．05人但各浓度间差异无统计学意义，而10％药物血 清只对100pM乙醒刺
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R575.2
【图文】：

经台盼蓝染色细胞存活率90%以上。2)免疫细胞化学染色显示，传代HSC纯度>98%。(见图1一l)3)HSC形态学观察:刚分离接种的HScs在倒置显微镜下为折光性很强的圆球，远小于肝细胞，原代培养24h后，细胞即贴壁，呈扁圆形，少量开始伸展，培养至3一5天细胞贴壁生长良好，大多数细胞伸出伪足，呈现梭性、多边形和星形状，胞质中脂滴明显。培养7d时，细胞开始融合形成特有的放射状排列，经过10一14d的原代培养，细胞分裂、增殖，由局灶性生长至长成单层，胞质中脂滴不明显，细胞面积明显增大，此时细胞呈现典型的成纤维细胞样形态，传代后细胞保持典型的成纤维细胞形态不变。2.乙醛及药物血清对HSC形态和生长的影响在乙醛浓度为100一300林M及正常血清和药物血清浓度为10%范围内，各药物组及对照组细胞生长状态良好，其形态无明显改变。3.乙醛及药物血清对HSC增殖的影响正常血清浓度为10%时，乙醛浓度为100林M(0.1836士0.O225vs

4.乙醛及药物血清对HSCS中TIMP一1mRNA表达的影响100卜M乙醛能明显增强HSC中TIMP一lmRNA的表达，10%药物血清能抑制其促进作用。(见图2一4)篡口对照.乙醛口药物山虎.呀，﨑IQ

本文编号：2740760