肝再生增强因子免疫抑制作用与调节性T细胞的关系及相关机制研究

发布时间：2020-07-05 14:48

【摘要】：第一部分肝再生增强因子对PBMC增殖的影响与调节性T细胞的关系’ 目的：肝再生增强因子(Augmenter of liver regeneration, ALR)具有免疫调节作用,但其发挥负性免疫调控作用的机制尚未明确。本部分课题拟通过观察人肝再生增强因子(Human augmenter of liver regeneration, hALR)在体外对ConA刺激的正常人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMC)的增殖和凋亡的影响以及对其中CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞(Regulatory T cell, Treg)亚群分化增殖的影响,探讨hALR免疫抑制作用的可能机制。 方法：以ConA刺激的健康人PBMC为实验细胞,分别设Control组、ConA组和ConA+hALR组。体外培养60h后用MTS法检测各组细胞增殖率,流式及免疫印迹法检测各组细胞的早期细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达,实时荧光定量PCR检测各组FoxP3的表达,流式检测各组细胞CD4+CD25+FoxP3+Treg的比例及细胞周期变化。 结果：hALR能够明显抑制ConA刺激的PBMC增殖(ConA组vs ConA+hALR组,P0.01),且hALR降低ConA引起的细胞凋亡(ConA组vs ConA+hALR组,P0.01)。hALR在抑制细胞增殖的同时,上调FoxP3基因的表达,提高Treg的比例(ConA组vs ConA+hALR组,P0.01),并且能够解除ConA导致的Treg亚群细胞周期G2/M期阻滞(ConA组vs ConA+hALR组,P0.01)。 结论：hALR能够显著抑制ConA刺激的PBMC增殖,但不是通过诱导PBMC凋亡实现的,而是具有抗凋亡作用,hALR同时上调CD4+CD25+FoxP3+Treg的比例,提示hALR可能通过诱导Treg来抑制ConA刺激的PBMC增殖。 第二部分肝再生增强因子诱导调节性T细胞发挥免疫抑制作用的机制 目的：细胞因子在Treg的分化增殖及免疫抑制作用中发挥重要作用,本研究拟通过观察hALR对各组细胞上清中细胞因子(TGF-β1、 IL-10、IL-2)水平的影响,以及对各组细胞信号通路分子(ERK1/2、 NF-κB)舌性及表达的影响,探讨hALR促进Treg分化增殖以及发挥免疫抑制作用的可能机制。 方法：以ConA刺激的健康人PBMC为实验细胞,分别设Control组、ConA组和ConA+hALR组。用ELISA方法分别检测培养16h和40h各组细胞上清中TGF-β1、IL-10、IL-2的水平,用免疫印迹法检测培养60h的各组细胞ERK1/2的活性和NF-κB (p65)的表达。 结果：hALR能够显著增加细胞培养上清中TGF-β1和IL-10的水平,降低IL-2的水平(ConA组vs ConA+hALR组,P0.01)。hALR能够显著抑制ERK1/2的活性和NF-κB (p65)的表达(ConA组vsConA+hALR组,P0.01)。 结论：hALR可以促进TGF-β1和IL-10产生而抑制IL-2产生,能够抑制ERK1/2的活性和NF-κB (p65)的表达,提示hALR对细胞因子的调控可能既是hALR上调Treg的条件也是其发挥免疫抑制作用的机制,在分子机制上则表现为对信号通路分子的调控。 第三部分肝再生增强因子对大鼠腹腔肝细胞移植免疫排斥的影响 目的：hALR体外能够上调Treg并抑制ConA活化的免疫细胞增殖,本部分研究拟通过观察腹腔内同种异体肝细胞移植(Hepatocyte transplantation, HCT)联合hALR治疗急性肝衰竭(Acute liver failure,ALF)大鼠的疗效,以及hALR对大鼠免疫排斥反应的影响,探讨hALR体内的免疫抑制作用及机制。 方法：以D-氨基半乳糖(D-galactosamine, D-GalN)诱导ALF的S-D大鼠为动物模型,半原位胶原酶灌注法新鲜分离的大鼠肝细胞腹腔内移植联合hALR治疗ALF大鼠,分为生理盐水(PS)组、HCT组、HCT+hALR组、hALR组。观察各组大鼠生存率,组织学分析腹腔内移植肝细胞存活情况,免疫组化检测大网膜免疫细胞CD68、CD4、CD8及Foxp3阳性率,流式检测腹腔内大网膜免疫细胞中CD4+CD25+FoxP3+Treg的比例,实时荧光定量PCR检测移植物周围大网膜免疫细胞TGF-β1、IL-10mRNA表达水平,ELISA检测腹水及血清中TNF-a和IL-1β水平。 结果：hALR联合HCT治疗能够显著提高大鼠生存率(P0.05),且hALR明显改善腹腔移植物存活情况,减少炎症细胞浸润。hALR明显降低大网膜免疫细胞CD68、CD4、CD8阳性率,增加Foxp3阳性率,上调大网膜免疫细胞中Treg的比例和TGF-β1、IL-10mRNA的表达,降低前炎症介质TNF-a和IL-1β水平(HCT组vs HCT+hALR组,P0.05)。 结论：hALR能够通过上调腹腔HCT的ALF大鼠腹腔大网膜内Treg的比例,抑制机体炎症反应和对腹腔移植物的免疫排斥反应,改善腹腔移植物存活,最终提高ALF大鼠存活率。这提示hALR在ALF大鼠体内同样具有免疫抑制作用,能够抑制机体对移植物的免疫排斥反应,促进移植耐受,而上调Treg可能是hALR发挥免疫调节作用的机制。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R575

【参考文献】

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本文编号：2742748