RCOR3在慢性肝炎中的作用及其机制的初步研究

发布时间：2020-07-07 02:40

【摘要】：1.研究背景及目的乙型病毒性肝炎是一种世界性疾病,感染者可发展为慢性肝炎,最终导致肝硬化和肝癌。全国现有慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者约3000万人其中约5%的患者将发展成为重型肝炎。一旦发展至重型肝炎,病人临床救治成活率不足40%。做到早期发现、早期干预,对于防止肝炎重症化的发生非常重要。因此,迫切需要找出早期预示疾病发生、监测疾病发展和严重程度的敏感、可靠的指标。我们前期基因芯片实验发现在ConA诱导的小鼠肝炎模型中RCOR3表达有显著差异。RCOR3是抑制元素-1沉默转录因子协阻抑因子(repressor element silencing transcription factor corepressor, CoREST)家族成员之一,其功能就是作为REST的协阻抑因子协助REST发挥转录抑制作用,REST抑制功能的发挥依赖于RCOR3目前为止,未见到关于REST (RCOR3)与乙型肝炎的相关研究报道。本研究旨在研究慢性乙型肝炎患者外周血RCOR3在不同病情状态下的差异表达,并分析其与临床炎症损伤指标的相关性,并通过探析抗炎制剂对RCOR3的调控作用及其机制,揭示RCOR3参与慢性乙型肝炎的作用机制。 2.研究方法 2.1RCOR3在慢性乙型肝炎患者血清中的表达情况采集22例慢性乙型肝炎轻度(CHB, Mild),34例慢性乙型肝炎中度(CHB, Moderate),47例慢性乙型肝炎重度(CHB, Severe),24例重型肝炎(SHB)以及34例健康对照者的外周血,分离血清后ELISA法检测RCOR3水平,同时进行肝功能(ALT, AST, TB)检测。 2.2动物实验研究RCOR3的作用机制 2.2.1ConA制备的爆发性肝炎小鼠肝组织中RCOR3动态变化情况根据小鼠体重按20mg/kg经尾静脉注射ConA制备肝损伤动物模型,正常对照组注射等量PBS。于Oh,1h,3h,6h摘眼球取血,处死小鼠取肝组织,生化及病理学检查评估各组小鼠肝组织损伤程度。小鼠肝组织匀浆后抽提RNA, Q-PCR检测RCOR3mRNA水平 2.2.2抗炎制剂(大黄素)对RCOR3的调控作用及其机制 (1)大黄素疗效观察六周龄雄性Balb/c小鼠随机分为正常对照组、大黄素组、模型组(ConA组)、治疗组(12.5mg/kg+ConA组)。治疗组按12.5mg/kg给予大黄素灌胃,2h后ConA尾静脉注射,ConA组以CMC-Na(大黄素溶剂)代替大黄素,大黄素组以生理盐水代替ConA,正常对照组不做处理。ConA10h摘眼球法取血,无菌取肝脏,生化及病理学检查评估各组小鼠肝组织损伤程度. ELISA)去检测小鼠血清RCOR3水平。 (2)时效关系研究六周龄雄性Balb/c小鼠随机分为正常对照组、大黄素组、模型组(ConA组)、治疗组(12.5mg/kg+ConA组)。治疗组按20mg/kg尾静脉注射ConA,分别于ConA前2h以及ConA后5min、10min、30min、1h后给予大黄素12.5mg/kg灌胃,ConA组以CMC-Na(大黄素溶剂)代替大黄素,大黄素组以生理盐水代替ConA,正常对照组不做处理。ConA10h摘眼球法取血,无菌取肝脏,生化及病理学检查评估各组小鼠肝组织损伤程度。 (3)量效关系研究六周龄雄性Balb/c小鼠随机分为正常对照组、大黄素组、模型组(ConA组)、治疗组(1.5625mg/kg+ConA组、3.125mg/kg+ConA组、6.25mg/kg+ConA组、12.5mg/kg+ConA组、25mg/kg+ConA组、50mg/kg+ConA组、1OOmg/kg+ConA组)。治疗组按1.5625mg/kg、3.125mg/kg、6.25mg/kg、12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg以及1OOmg/kg给予大黄素灌胃,2h后ConA尾静脉注射,ConA组以CMC-Na(大黄素溶剂)代替大黄素,大黄素组以生理盐水代替ConA,正常对照组不做处理。ConA10h摘眼球法取血,无菌取肝脏,生化及病理学检查评估各组小鼠肝组织损伤程度。 (4)作用机制研究取正常对照组、大黄素组、模型组(ConA组)、治疗组(12.5mg/kg+ConA组)小鼠肝组织匀浆抽提RNA, Q-PCR检测各组小鼠肝组织中MIP2及其受体CXCR2的核酸水平。 2.3统计学分析用统计学软件SPSS16.0for Windows分析实验数据,数据以均数±标准误(Mean±SE)表示,当数据服从正态分布且方差齐时,多组间两两比较采用单因素方差分析(ANOVA),当数据不服从正态分布或方差不齐时,多组间比较采用Kruskal Wallis检验,两组间比较用Mann-Whitney U检验。相关性分析采用Spearman关联分析。以P0.05为差异有统计学意义。 3.研究结果 3.1慢性乙型肝炎患者与健康人血清中RCOR3的表达水平相对于健康对照者(1.30±0.60),RCOR3蛋白在CHB轻度(1.82±0.24)、中度(1.72±0.85)以及重度患者(3.96±0.48)血清中的水平明显升高(p0.01),而在SHB患者(0.92土0.09)的水平明显降低,差异极其显著(p0.01)。此外,RCOR3蛋白在CHB重度患者血清中的水平较轻中度患者明显升高(p0.01),而SHB患者血清中RCOR3的水平较CHB轻中重度患者表达水平均显著降低(p0.01)。相关性分析显示,CHB患者血清RCOR3水平与血清TB水平呈正相关性(r=0.466.P0.01)。 3.2动物实验研究RCOR3的作用机制 3.2.1ConA制备的爆发性肝炎小鼠肝组织中RCOR3动态变化情况 Q-PCR结果显示,与正常对照组(1.01±0.09)相比,RCOR3在ConA1h (0.76±0.14)的表达降低不显著,在ConA3h (1.15±0.14)(?)ConA6h(1.60±0.10)组的表达明显升高,差异极其显著(p0.01)。而3h组明显高于1h组(p0.05),6h组明显高于3h组(p0.05)。 3.2.2抗炎制剂(大黄素)对RCOR3的调控作用及其机制 (1)疗效观察生化及病理学检查均显示大黄素以12.5mg/kg给药具有保护小鼠肝脏的作用。模型组(1.66土0.52)小鼠血清中RCOR3蛋白水平明显高于正常对照组(0.003±0.002),差异具有显著性(p0.05)。而大黄素干预组(0.10±0.08)RCOR3蛋白水平明显低于模型组(p0.05) (2)时效关系研究 ConA诱导前2h给予大黄素(12.5mg/kg+ConA组)灌胃,可以减轻ConA诱导的小鼠肝损伤程度。与ConA组(ALT：1647.0±163.24,AST：1139.0±102.79)相比较,大黄素干预组小鼠血清ALT(165.71±34.49)、 AST(290.0±76.28)水平显著下降。病理切片亦显示满视野几无坏死,炎细胞浸润也减少。而ConA诱导后5min、10min、30min、1h给药不具有保护肝脏的作用。 (3)量效关系研究 COnA诱导前2h给予给予大黄素100mg/kg(ALT:6496.0±1289.8,AST:4070.0±761.3)灌胃会加重小鼠肝损伤。而给予大黄素1.5625mg/kg(ALT:592.0±327.9, AST:596.0±207.2).3.125mg/kg(ALT:574.0±253.9, AST:596.0±169.8).6.25mg/kg(ALT:433.3±244.5,AST:466.7±188.7).12.5mg/kg(ALT:165.7±34.5,AST:290.0±76.28).25mg/kg(ALT:161.4±39.8,AST:248.6±28.9).50mg/kg(ALT:205.4±22.23,AST:289.2±30.31)灌胃其ALT、AST水平均较模型组明显降低,而12.5mg/kg、25mg/kg.50mg/kg三组ALT.AST水平降低更明显,但是组间无统计学差异。这三组小鼠肝组织病理切片亦显示满视野几无坏死,炎细胞浸润也减少。这表明大黄素以12.5mg／kg给药即具有保护小鼠肝脏的作用。 (4)作用机制研究 Q-PCR实验发现,ConA组MIP2(494.7±125.0)及其受体CXCR2(21.5±5.4)显著升高,大黄素可以显著抑制MIP2(62.5±24.5)及其受体CXCR2(8.4±1.0)的水平。相关性分析显示,小鼠血清RCOR3水平与MIP2及其受体CXCR2呈显著正相关(1=0.746,P0.01；r=0.764,P0.01) 4.研究结论 (1)CHB轻度、中度和重度患者血清中RCOR3表达水平明显高于健康人,而SHB患者明显低于健康人和慢性乙型肝炎轻度、中度和重度患者,且CHB患者血清中RCOR3表达水平与血清TB水平呈显著正相关。提示RCOR3参与了慢性乙型肝炎患者疾病的进展以及肝脏炎症损伤的病理过程。 (2)大黄素通过MIP2／CXCR2途径抑制RCOR3的表达,导致RCOR3对抗炎因子抑制作用的减弱,从而减轻了小鼠肝损伤程度。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R575.1

【参考文献】