磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）对乙型肝炎病毒表面抗原表达的影响

发布时间：2020-07-07 23:50

【摘要】： 对大多数在宿主细胞核内复制的病毒来说,病毒RNA输出(RNA export)是其基因转录后调节的重要步骤之一。1993年在HBV基因组上发现的一个片段(1151nt-1684nt)被定义为乙型肝炎病毒(HBV)转录后调节元件PRE(HBV post-transcriptional regulatory element, HPRE)。现有的研究认为其具有辅助转录产物从细胞核向细胞浆运输的功能,但机制尚未清楚。Zang等人用带电泳迁移率变动分析(EMSA)发现两种细胞蛋白能够与HPRE相互作用,其中一个35kDa的蛋白为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。但GAPDH如何影响HBV的复制和表达,目前还没有具体报道。本实验的研究目的在于从体外验证GAPDH与HPRE-RNA的结合作用,利用检测系统pDM138-HPRE探讨GAPDH在HPRE转录后调节的作用,然后过量表达GAPDH于HepG2 2.2.15细胞和瞬时表达HBs的细胞中,检测HBs表达量来阐明GAPDH在HBV的转录后调节机制中的功能。 主要研究方法和研究结果: 1.用线性化pGEM-HPRE质粒作为模板,在Biotion标记的碱基体系中用T7 RNA聚合酶,以体外转录的方法合成HPRE-Biotin RNA。在BL21(DE3)细菌里诱导大量表达重组体pET32a(+)-GAPDH的GAPDH-His蛋白,获得大量56KDa的蛋白,再采用Ni2+-NTA树脂亲和纯化,以SDS-PAGE进行初步鉴定,并以兔抗人GAPDH和抗His标签抗体来进行Western blot蛋白鉴定。 2.利用M-280 Streptavidin磁珠和Biotin的特异性结合,可用磁力座分离复合物的特性,将洗涤后的沉淀复合物做Western Blot鉴定。用抗His和抗GAPDH单克隆抗体检测,实验组GAPDH-His+HPRE-Biotin RNA能形成复合物,可鉴定出目的蛋白条带,而对照组His+HPRE-Biotin RNA则没有条带出现。由此证明GAPDH-His蛋白能够与HPRE RNA结合。 3.将表达人类GAPDH基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-GAPDH ,与含CAT报告基因的pDM138及pDM138-HPRE和表达绿色荧光蛋白(GFP)的pEGFP-N1分组共转染293T细胞,转染48小时后通过流式细胞仪测定pEGFP-N1表达的GFP,来评估转染效率。用ELISA方法检测报告基因CAT的表达来验证蛋白GAPDH对HPRE功能的影响。报告基因CAT表达量经统计学分析显示:转染质粒pDM138-HPRE的细胞CAT表达明显增加;而共转染质粒pDM138-HPRE和pcDNA3.1(+)-GAPDH,CAT的表达受到明显抑制(p0.05)。 4.将GAPDH蛋白的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-GAPDH转染于HepG2 2.2.15细胞和瞬时表达HBs的293T细胞中,通过ELISA检测HBs的表达量。应用统计学分析显示:GAPDH蛋白在HepG2 2.2.15中过度表达对HBs的表达有明显的抑制作用(p0.05)。通过对比pcDNA3.1(+)-HBs与pcDNA3.1(+)-HBs-HPRE的实验结果,证实GAPDH蛋白对HBs表达的抑制作用是通过HPRE来发挥的。 结论:GAPDH和HPRE RNA能够在体外结合,并且GAPDH是HPRE的抑制性蛋白,能通过HPRE来调节HBs抗原的表达。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R512.62
【图文】：

T32a(+)-GAPDH 重组质粒的构建。A, M 为 λ-EcoT14 I digest D体pET32a(+)用BamHI和SalI限制性内切酶双酶切结果；2为PCpET32a(+)-GAPDH 重组质粒用 BamHI 和 SalI 限制性内切酶双truction of pET32a(+)-GAPDH plasmid. A, M is λ-EcoT14 I digesestion result of prokaryotic expression vector pET32a(+) with Bact of the GAPDH. B, 1 is double digestion result of pET32a(+)-Gwith BamHI and SalI. 诱导后的重组表达菌 BL21 菌液离心收集细菌沉淀后，以白，分管收集得到的重组质粒蛋白(图 1-2A)和对照蛋白GE 检测呈现出特异性扩增条带，与预期值相符。

APDH 重组质粒的构建。A, M 为 λ-EcoT14 I digesa(+)用BamHI和SalI限制性内切酶双酶切结果；2为P)-GAPDH 重组质粒用 BamHI 和 SalI 限制性内切酶f pET32a(+)-GAPDH plasmid. A, M is λ-EcoT14 I digult of prokaryotic expression vector pET32a(+) with BAPDH. B, 1 is double digestion result of pET32a(+)-with BamHI and SalI.重组表达菌 BL21 菌液离心收集细菌沉淀后，收集得到的重组质粒蛋白(图 1-2A)和对照蛋呈现出特异性扩增条带，与预期值相符。

22t 结果 A, 用抗 His-tag 抗体进行 Western白；2 为 Ni2+亲和层析柱纯化获得的 His-GPDH 单克隆抗体进行 Western btotting 鉴定获得 His-GAPDH 融合蛋白；3、4 为用 N白。lot analysis. A, Identification with anti-His; M is protein marker. B, Identification wit marker; 1-2 are His-GAPDH protein; 3-4 a Western blot 鉴定结果”中所介绍获得生物素标记的 HPRE 相应的实验体系中， 经过磁珠结合实blot 方法分析，应用抗 His（图 1-4A）

【相似文献】

相关会议论文 前10条

1 肖冬来;贾东升;吴建国;吴祖建;谢联辉;;水稻条纹病毒NS3蛋白与水稻GAPDH间的互作[A];中国植物病理学会2010年学术年会论文集[C];2010年

2 宋时英;沈月全;张雅群;林政炯;;SNAD~+-GAPDH的分子不对称性[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年

3 黄科;李春峰;范晓东;刘文明;周泽扬;;家蚕gapdh基因的克隆及分析[A];中国蚕学会第六届青年学术研讨会论文集（1）[C];2009年

4 马凌波;张凤英;;条斑紫菜叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶的cDNA克隆和序列分析(英文)[A];可持续水产养殖——资源、环境、质量——2003水产科技论坛论文集[C];2003年

5 姜崴;宫本高秀;柿泽供子;;甲状腺激素受体TRα在脂肪细胞分化中调节GAPDH的表达[A];中华医学会第十次全国内分泌学学术会议论文汇编[C];2011年

6 徐安定;谭少华;;缺氧时星形胶质细胞定量mRNA表的内部参照标准研究[A];中华医学会第七次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2004年

7 陈佩杰;王茹;董强刚;;生理状态下外周血中γ干扰素、白细胞介素2、白细胞介素4和白细胞介素10基因表达的荧光定量PCR检测[A];第七届全国体育科学大会论文摘要汇编（二）[C];2004年

8 蒋锦祺;董强刚;黄进肃;叶剑定;余熙彦;周敏杰;;治疗濒危期非小细胞肺癌1例报道[A];2004年全国危重病急救医学学术会议论文集[C];2004年

9 邹跃;周湘艳;;RNA干扰抑制端粒酶表达及增强射线诱导肿瘤细胞凋亡的实验研究[A];第七届全军防原医学专业委员会第五届中国毒理学会放射毒理专业委员会学术会议论文汇编[C];2004年

10 曾鸣;王笑云;王小兵;赵秀芬;邢昌赢;;膦甲酸钠对尿毒症大鼠肾脏Ⅱa型Na-Pi转运体的影响[A];“中华医学会肾脏病学分会2004年年会”暨“第二届全国中青年肾脏病学术会议”论文汇编[C];2004年

相关重要报纸文章 前1条

1 由中国科学院生物物理研究所王志珍等完成;蛋白质二硫键异构酶的分子伴侣活性以及分子伴侣帮助的蛋白折叠[N];中国医药报;2003年

相关博士学位论文 前10条

1 卢秉国;龙眼子叶胚发育相关的若干基因克隆及序列分析[D];福建农林大学;2009年

2 郭凯文;ASAP3对人肝癌细胞侵袭转移能力的影响[D];华中科技大学;2011年

3 刘军;CUGBP1在人星形细胞瘤中的表达及其敲减后对U251细胞的影响机制研究[D];第二军医大学;2011年

4 袁俊斌;肾癌中EZH2表达的临床意义及靶向EZH2的siRNA对肾癌ACHN细胞影响的实验研究[D];中南大学;2011年

5 赵长安;铝致阿尔茨海默病大鼠的效应及补肾填精方的防治机制[D];河北医科大学;2002年

6 张子新;通心络抑制家兔血管成形术后内膜增殖及血管重构的研究[D];中国医科大学;2002年

7 柳昊;骨桥蛋白shRNA表达载体介导RNA干扰抑制前列腺癌PC-3细胞生长和侵袭[D];华中科技大学;2010年

8 章玉冰;MMP-3、MMP-9在创伤性深静脉血栓形成中作用的实验与临床研究[D];昆明医学院;2011年

9 韩凯凯;捻转血矛线虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA疫苗的免疫保护作用与烯醇化酶特性的研究[D];南京农业大学;2011年

10 李凌浩;上调Fas表达增强前体T淋系肿瘤细胞体外凋亡敏感性及抑制其动物体内肿瘤形成[D];苏州大学;2011年

相关硕士学位论文 前10条

1 崔丽荣;抗旱小麦长武134 GAPDH基因的表达及克隆[D];西北农林科技大学;2010年

2 李小勇;海洋鱼类细菌性病原微生物GAPDH蛋白的定位和功能初步研究[D];华东理工大学;2011年

3 梁顺庆;光谱型抗原蛋白GAPDH的免疫保护机制分析及保护效果关键区域的定位[D];华东理工大学;2012年

4 梁颖;星星草GAPDH和OPDR基因的克隆与表达分析[D];东北林业大学;2010年

5 李毅;磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）对乙型肝炎病毒表面抗原表达的影响[D];重庆医科大学;2009年

6 曹彦妮;油茶FBPase基因和GAPDH基因的全长cDNA克隆及原核表达分析[D];中南林业科技大学;2011年

7 赵艳;在鳗弧菌表面展示嗜水气单胞菌抗原蛋白GAPDH[D];华东理工大学;2011年

8 郑雁;在减毒鳗弧菌中采用多种方法表达迟钝爱德华氏菌抗原GAPDH以及多价疫苗的构建和评价[D];华东理工大学;2011年

9 夏春雷;乳房链球菌GapC蛋白的表达及免疫保护研究[D];黑龙江八一农垦大学;2008年

10 代霄燕;重组A群链球菌三磷酸甘油醛脱氢酶与脂蛋白（a）的相互作用[D];内蒙古农业大学;2011年

本文编号：2745792