肠道菌群失调与胆汁酸代谢紊乱在结肠炎相关肠癌中的作用

发布时间：2020-07-10 02:05

【摘要】：目的结直肠癌(colorectal cancer,CRC)已经成为第三常见的恶性肿瘤及癌症相关死亡的主要原因之一。研究表明随着炎症性肠病患者病史的延长,CRC患病率明显升高,即结肠炎相关肠癌(colitis-associated cancer,CAC)。除肠道炎症外,参与CAC发病的因素还包括免疫反应、表观遗传学的改变及肠道菌群失调。肠道菌群失调促进多种肠道疾病的发生,同时也影响胆汁酸代谢。胆汁酸在肠道菌群作用下发生去结合、氧化、7α-脱羟基化、酯化和脱硫等代谢过程,并参与维持胆固醇代谢、营养物质的消化吸收以及机体代谢稳态。胆汁酸还可以激活胆汁酸受体法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)及G蛋白偶联胆汁酸受体-1(G protein-coupled bile acid receptor 1,TGR5),FXR及TGR5具有调节肠粘膜屏障、肠道炎症及菌群组成的作用。本研究构建CAC模型,旨在探索肠道菌群失调与胆汁酸代谢紊乱在肠道肿瘤进展中的作用,为肠道肿瘤的治疗提供新的思路。方法SPF级7周龄雌性C57BL/6小鼠20只,随机分为对照组和炎癌组。适应环境1周后,第0周留取两组小鼠的粪便用于菌群检测。实验第1天,炎癌组于腹腔注射10mg/kg氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM),对照组腹腔注射0.9%生理盐水作为对照。分别于实验第8-12天、27-31天及46-50天给予炎癌组5天1.5%葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)饮用水,每次DSS饮水后给予2周无菌饮用水,对照组始终给予无菌饮用水。每天密切观察小鼠饮食饮水、排便及一般情况,每周末记录小鼠体重。第10周末,收集小鼠粪便后处死小鼠。量取结肠长度,并记录脾重。纵行剖开肠段后,于解剖显微镜下观察肠道肿瘤分布、数量及大小情况。留取部分结肠,保存于10%福尔马林溶液中以备石蜡包埋。将结肠及小肠组织冻存于-80℃冰箱,用于后续实验。(1)蜡块组织切片后,进行HE染色评估肠道炎症情况及肠道肿瘤癌变程度。(2)Realtime-PCR方法检测小鼠结肠组织炎性细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α表达情况。(3)采用Realtime-PCR方法检测结肠组织紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin1及Claudin3的mRNA水平。(4)采用16S rRNA高通量测序方法检测两组小鼠第0周及第10周末粪便菌群的组成。对原始数据进行质控后,将相似度达97%的Reads进行聚类获得操作分类单元(Operational Taxonomic Units,OTUs)。与16S数据库对比,对每个OTU进行物种分类。运用QIIME统计方法对炎癌组及对照组进行Alpha多样性及Beta多样性分析。(5)采用液相色谱-质谱联用技术检测粪便胆汁酸水平。样本经预处理后,根据质谱仪分析结果绘制标准曲线,通过曲线峰面积计算出每个样本胆酸、鹅去氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸及鼠胆酸的浓度。(6)采用Realtime-PCR方法检测小鼠回肠末端组织FXR、成纤维细胞生长因子15(fibroblast growth factor 15,FGF15)及胆汁酸转运载体顶端钠依赖性胆汁酸转运体(apical sodium-dependent bile acid transporter,ASBT)、有机溶质转运体(organic solute transporter alpha-beta,OSTα-OSTβ)的mRNA水平。Realtime-PCR及免疫组化方法检测结肠组织TGR5的表达水平。结果炎癌组小鼠给予DSS饮水期间体重下降明显且观察到血便,结肠可见多个肿瘤。对照组未观察到便中有血及肿瘤形成。AOM/DSS处理后小鼠结肠出现严重炎症反应,且肠粘膜屏障受到破坏,表现为炎性细胞因子表达增多,紧密连接蛋白表达减少。与对照组相比,炎癌组菌群物种多样性及丰度减少,门水平Bacteroidetes丰度下降,Firmicutes升高;属水平上,炎癌组致病菌螺杆菌属及链球菌属表达增多,产短链脂肪酸菌Lachnospiracea_incertae_sedis、Alistipes及Odoribacter表达下降,表明CAC发展过程中有益菌减少,致病菌表达增多。此外,炎癌组参与胆汁酸代谢的梭菌亚群XlV及乳酸菌属表达下降,表明炎癌组胆汁酸去结合、转化及脱硫能力下降,表现为粪便中游离胆汁酸水平下降,初级胆汁酸向次级胆汁酸转化的能力降低。CAC模型中FXR-FGF15信号轴下调,结肠肿瘤部位TGR5的表达增多。结论CAC发展过程中,肠道菌群失调影响胆汁酸的代谢与组成,导致具有抗炎作用的次级胆汁酸表达减少,在胆汁酸受体的共同作用下促进肠道肿瘤进展。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R735.3;R574.62
【图文】：

曲线,小鼠,体重变化,对照组

天津医科大学硕士学位论文结果/DSS 模型小鼠肠道肿瘤形成情况一般状态及排便情况察两组小鼠的饮食饮水、排便及一般情况，对照组小鼠长状态佳，进食饮水良好，排便正常，粪便中未见便中SS 组）有 2 只小鼠在 DSS 饮水第二个循环中因症状严 DSS 饮水后，小鼠的体重呈现下降趋势，观察小鼠粪便现血便。对照组与 AOM/DSS 组小鼠体重在实验开始时5±0.23g，P＞0.05），差别无统计学意义。实验期间每周进行记录，对照组体重呈现平稳持续上升，而 AOM/DSS循环中可见明显的体重下降，见图 1。

组结,肠肿瘤,对照组,脾脏

图 2 两组小鼠肠道肿瘤形成情况（A：对照组与 AOM/DSS 组结肠长度与脾脏重量；B：对照组与 AOM/DSS 组结肠腔内大体表现，AOM/DSS 组结肠肿瘤的数量与大小。**，P＜0.01）2.2 结肠炎相关肠癌肠道炎症情况2.2.1 结肠病理学特征对照组结肠无肿瘤形成，AOM/DSS 组 HE 染色结果显示结肠肿瘤及肿瘤旁部位较对照组可见明显炎性细胞浸润，病理表现为粘膜内癌伴中-高级别上皮内瘤变，见图 3。2.2.2 肠道炎症细胞因子的表达Realtime-PCR 检测两组结肠炎症情况。结果显示：AOM/DSS 组较对照组相比，炎性细胞因子 IL-1β、IL-6 及 TNF-α 的 mRNA 表达水平明显升高，具有显著的统计学差异。表明结肠炎相关肠癌结肠产生明显炎症反应，见图 3。

对照组,HE染色,肿瘤,部位

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