HBV诱导趋化因子Mig表达及其介导炎性细胞肝脏聚集的动物实验研究

发布时间：2020-07-13 14:28

【摘要】：目的：HBV感染是影响人类健康的重要疾病之一,全球约有3.5亿HBV慢性携带者,其中大量患者肝脏病变呈慢性化趋势。由于HBV并不直接致肝细胞病变,目前认为肝组织损伤主要是HBV感染后机体免疫应答异常的结果,特异性和非特异性炎性细胞在肝组织内的浸润起关键作用。研究发现,细胞因子分泌异常与HBV感染后肝脏炎症的慢性化及肝细胞的损伤存在密切关系。然而,到底何种细胞因子招募炎性细胞到达HBV感染后的肝脏目前尚不清楚。本研究拟在动物模型体内探讨HBV感染对趋化因子Mig表达的诱导作用及其机制,并研究Mig在肝脏炎性细胞招募和肝组织损伤中所发挥的作用。方法：构建HBV全基因组腺病毒载体,感染3种肝源性细胞株：人胎肝细胞株L02、人肝癌细胞株SMMC-7721及HepG2,定量PCR及ELISA检测培养上清中HBV DNA拷贝数及HBsAg、HBeAg的表达量,RT-PCR及Western blot检测细胞中HBx的表达,证实该病毒感染体外培养的肝源性细胞株的能力。HBV小鼠模型的建立,将90只BALB/c小鼠随机分为3组,分别通过尾静脉注射将表达HBV全基因组的腺病毒载体(Ad-HBV)、腺病毒空载体(Adenovirus)或生理盐水(Control)注入到小鼠体内；采用ECLIA及ELISA方法检测动物模型体内HBsAg、趋化因子Mig的分泌及小鼠体内转氨酶浓度,原位杂交检测肝组织中Mig RNA的表达；定量PCR检测HBVDNA和cccDNA拷贝数；应用Western blot方法检测肝组织中NF-κB p50和p65亚基的表达,免疫荧光技术检测NF-κBp50和p65亚基在肝细胞内的分布,观察NF-κB抑制剂MG-132对HBV诱导Mig分泌的影响；同时,Western blot检测Ad-HBV对NF-κB相关的信号转导蛋白p38、ERK1/2、JNK、PI3K磷酸化的影响；利用HE染色观察肝脏炎性灶大小、数量；流式细胞技术分析各种炎性细胞在小鼠肝组织的比例。设计合成Mig-siRNA, RT-PCR及ELISA检测小鼠肝细胞株中Mig表达的变化。根据Mig-siRNA检测结果,构建Mig mRNA的干扰质粒及阴性对照质粒,酶切及测序鉴定重组体。重组体与去唾液酸蛋白形成去唾液酸-聚乙烯亚胺-DNA复合物后,通过尾静脉注射法注入HBV小鼠模型体内,ELISA检测上述干预后小鼠血清中Mig的表达及病毒抗原HBsAg、HBeAg的含量,定量PCR检测HBV DNA和cccDNA拷贝数,测定上述干预后小鼠体内转氨酶浓度,HE染色观察肝脏炎性灶大小、数量的变化,流式细胞术分析上述干预后各种炎性细胞在肝脏中的比例。结果：酶切鉴定结果证明1.3拷贝HBV全基因组腺病毒载体构建成功,经包装、收毒、扩增后获得物理滴度为6.138x1012VP/ml、精确滴度为2.5x1011PFU/ml的Ad-HBV病毒颗粒。Ad-HBV具有感染体外培养细胞株的能力(L02、SMMC-7721、HepG2),三种受感染的细胞均表达HBx,培养上清中均可检测到HBsAg、HBeAg及HBV DNA。与腺病毒空载体组及生理盐水组相比较,Ad-HBV感染BALB/c小鼠后在小鼠血清中可检测到HBsAg、HBeAg (p0.05)、HBV DNA、cccDNA并且ALT浓度明显增高p0.01)。随着感染时间的延长,HBeAg及HBV DNA逐渐降低,血清中开始出现抗HBs和HBe抗体,其表达量随时间而增加。ELISA及原位杂交方法检测结果显示Ad-HBV感染后小鼠血清中趋化因子Mig表达显著增加p0.05),并且Mig主要在肝细胞和内皮细胞胞浆中表达。免疫荧光及Western blot实验结果显示Ad-HBV感染后小鼠肝组织中NF-κB信号通路被激活,其亚基p50、p65从胞浆向胞核转位；NF-κB抑制剂MG-132可有效抑制NF-κB的激活,并阻断Ad-HBV诱导的趋化因子Mig分泌(427.64±110.1)(P0.01)。此外,通过Western blot检测我们还发现Ad-HBV感染后肝组织中NF-κB上游信号通路PI3K/Akt、JNK、ERK1/2信号通路被激活。Akt、JNK、ERK1/2蛋白磷酸化水平显著增加,而Ad-HBV并未引起p38蛋白磷酸化水平的显著变化。HE染色结果显示Ad-HBV感染后小鼠肝脏炎症灶形成,表现为以门管区淋巴细胞浸润为主的炎症,流式细胞术分析发现小鼠肝脏淋巴细胞数量显著增加,主要以CD4+、CD8+、NK及NKT细胞为主。设计Mig-siRNA转染小鼠肝细胞株,Mig表达显著下降,筛选出抑制率最高的siRNA2成功构建Mig-shRNA重组体,与去唾液酸蛋白结合形成复合体后注射入小鼠体内可部分抑制小鼠体内Mig的表达(551.4±65.7)p0.01),同时抑制肝脏炎性细胞的招募(P0.05),降低ALT浓度(第7日：148.0±17.0,第14日：100.3±25.9)(p0.01),减轻肝组织损伤。然而,Mig表达的抑制对病毒抗原HBsAg、HBeAg的含量、HBV DNA及cccDNA拷贝数无显著影响。结论：腺病毒能有效地将HBV基因组导入小鼠肝细胞,HBV通过激活NF-κB信号通路诱导小鼠体内趋化因子Mig表达,从而招募炎性细胞在肝脏聚集导致肝损伤,这有助于进一步阐明乙型病毒性肝炎的发病机制,为其免疫调节治疗提供实验依据。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R512.62

【参考文献】