中药肝复康对肝纤维化时RHO通路干预的实验研究

发布时间：2020-07-14 07:34

【摘要】：目的：肝纤维化是肝脏受损后机体可逆的伤口愈合反应阶段，以ECM（extracellular matrix）沉积为特点。如果不及时治疗，将会导致肝硬化的形成。所以抗肝纤维化治疗具有非常重要意义，但是目前对肝纤维化的机制尚不明确。RHO信号通路主要是调节细胞收缩，迁移，增殖，形态以及基因的表达。这个信号通路与很多疾病密切相关，如血管痉挛，肾纤维化，神经损伤，肺动脉高压等。所以RHO信号通路具有潜在的临床治疗价值。本实验的目的是为了研究肝复康对肝纤维化时RHO信号通路干预的实验研究。方法：整体实验：健康的SD大鼠随机被分为正常组，肝纤维化模型组及三组药物治疗组。正常组予皮下注射生理盐水（0.5ml/kg），其余各组予等体积橄榄油稀释的10%CCl4皮下注射，每周两次，共12周。三组康复康中药处理组分别为：高剂量组（3125mg/kg/day），，中剂量组（312.5mg/kg/day）及低剂量组（31.25mg/kg/day）。在第九周开始给大鼠予肝复康高、中、低剂量治疗。正常组与模型组在12周末处死并迅速取出肝组织，中药治疗组于第20周处死并取出肝组织，立即储存于-70OC冰箱中。HE染色法观察肝组织病理结构的变化，逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测组织中RHOA，ROCKI,FAK, vinculin的mRNA水平的表达，免疫组织化学和免疫蛋白印记法（werstern blot）检测组织中ROCKI蛋白水平的表达。离体实验：HSC-T6细胞培养在加入了10%胎牛血清，100U/ml青霉素G及100U/ml链霉素的DEMN培养基中，并置于孵育箱中培养（37OC，5%CO2及95%O2）。每两天换液一次。细胞传代后，实验在呈指数生长的细胞中进行。实验随机分为三组：正常对照组（DEMN培养液+10%正常大鼠血清+HSC细胞），模型组（DEMN培养液+终浓度200umol/L乙醛+10%正常大鼠血清+HSC细胞），肝复康治疗组（DEMN培养液+终浓度200umol/L乙醛+10%肝复康中剂量组大鼠血清+HSC细胞）。逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测细胞中RHOA，ROCKI,FAK, vinculin的mRNA水平的表达，免疫蛋白印记法（werstern blot）检测细胞中ROCKI在蛋白水平的表达。结果：（1）肝复康对大鼠肝组织中RHO信号通路相关因子表达的影响：HE染色观察到正常肝组织肝小叶结构完整，肝索呈放射状排列，肝细胞形态正常，无脂肪空泡。模型组可见假小叶生成，正常肝小叶被破坏，多数肝细胞出现脂肪变，大量炎症细胞浸润。中药治疗组肝组织纤维化表现不同程度的改善，以中剂量组最为明显。RT-PCR结果显示，在肝组织中RHO通路相关因子RHOA,ROCKI,FAK,vinculin在模型组均有明显表达，而在正常组表达极少，肝复康治疗组均使以上因子不同程度的下调，而中剂量治疗效果最为明显。免疫组织化学和western blot结果显示，在正常组ROCKI蛋白表达很微弱，而在模型组ROCKI的表达明显上调，中药治疗组均不同程度的使ROCKI表达下调，以中剂量治疗组最为明显，结果具有统计学意义（P0.05）。（2）肝复康对大鼠HSC-T6细胞株中RHO信号通路相关因子表达影响：RT-PCR结果显示，RHO通路相关因子RHOA,ROCKI,FAK, vinculin在乙醛组均有明显表达，而在正常组表达极少，肝复康中剂量治疗组均使以上因子不同程度的下调，western blot结果显示，在正常组ROCKI蛋白表达很微弱，而在乙醛组ROCKI的表达明显上调，肝复康中剂量治疗组ROCKI表达明显减少，结果具有统计学意义（P0.05）。结论：1.RHO信号通路可能通过调节肝星状细胞的增殖，迁移，粘附促进肝纤维化。 2.肝复康对肝纤维化有明显的治疗作用，其机制可能与抑制RHO信号通路有关。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R285.5;R575.2

【参考文献】