蛋氨酸类似物调节鸡肠道紧密连接蛋白表达与机理研究

发布时间：2020-07-14 22:41

【摘要】：热量限制(Calories Restrictions, CR)有利于延长寿命,防止与年龄相关疾病的发生。蛋氨酸限制(Methionine Restrictions, MR)也表现出相似的作用。增强紧密连接(Tight Junction, TJ)蛋白Claudin表达、提高上皮细胞屏障功能,是MR的重要特征之一。作为蛋氨酸替代物的蛋氨酸羟基类似物(2-hydroxy-4-(methylthio) butanoic acid, HMTBA)及其钙盐(2-hydroxy-4-(methylthio) butyrate calcium, HMTBA-Ca)在体内不能直接被吸收利用,必须先转化为L-蛋氨酸才能参与机体代谢从而发挥作用,具有缓慢释放蛋氨酸的特点,可能达到MR的目的。本研究假设蛋氨酸类似物可发挥MR作用,调节TJ蛋白表达。旨在研究蛋氨酸类似物影响TJ蛋白表达的规律及机制。以250只1日龄雄性罗斯肉鸡(42±3g)为动物模型,随机分为对照组(Control)、蛋氨酸限制组(MR1、MR2、MR3)和蛋氨酸替代物组(H1、H2、H3、HC1、HC2.HC3)。分别饲喂基础日粮添加不同剂量蛋氨酸与蛋氨酸替代物(蛋氨酸羟基类似物及其钙盐),在实验的第21日和第46日断颈取血处死取样,并测定体重和腹脂率。取十二指肠、空肠、回肠和盲肠,测定还原型与氧化型谷胱甘肽的比值(GSH/GSSG)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)。采用荧光原位杂交-流式细胞计数法(FISH-FC)分析盲肠内容物中菌群结构。利用实时荧光定量PCR法分析十二指肠、空肠和盲肠组织Claudin-3、Occludin、TLRs、MyD88、NF-κB、AvBDs、IL-2、 IL-8、IL-18等基因的表达。 21日龄实验结果显示：H2与H3组均可显著提高肠道组织T-AOC水平(P0.05),降低MDA水平(P0.05)。HC2与HC3组可显著提高十二指肠、空肠和回肠的CAT水平并降低MDA含量(P0.05)。此外,H2组中十二指肠、回肠和盲肠的GSH/GSSG显著提高(P0.05)。与Control相比,H3和HC3组中十二指肠、空肠的Claudin-3、Occludin基因相对表达量均显著提高(P0.05),MR3组中十二指肠Claudin-3、Occludin基因表达显著上调(P0.05)。H3与HC3组中十二指肠TLRs、MyD88、NF-κB、AvBDs基因表达显著上调(P0.05),空肠TLR1、TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB、AvBD7基因表达也显著上调(P0.05)。H2组可显著提高盲肠中乳杆菌、双歧杆菌等有益菌含量,使粪肠球菌、大肠杆菌等显著降低。此外,H2、H3组的腹脂率显著降低(P0.05)。相关性分析显示,十二指肠Claudin-3、Occludin与MyD88、NF-κB、TLR4等基因均呈现显著正相关(P0.01),与CAT显著正相关(P0.05),与MDA显著负相关(P0.01)。空肠Claudin-3、Occludin与MyD88、NF-κB、TLR2、TLR4、IL-2等免疫相关基因呈显著正相关(P0.01)。46日龄实验结果显示：H1组中十二指肠和回肠的T-AOC水平显著提高(P0.05),空肠和盲肠的GSH/GSSG显著升高(P0.05)。HCl组中回肠和盲肠的GSH/GSSG与T-AOC水平显著提高(P0.05)。H1、H2、HC1和HC2组中空肠MDA含量显著降低(P0.05)。H1与HC1组可显著降低回肠MDA水平(P0.05)。H2与HC2组中十二指肠Claudin-3、Occludin、TLRs、MyD88、NF-κB、AvBDs基因表达显著上调(P0.05),空肠Claudin-3、Occludin、TLR1、TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB、AvBD7基因表达显著上调(P0.05)。H2组盲肠中乳杆菌、双歧杆菌等有益菌含量显著升高,粪肠球菌、大肠杆菌含量显著降低。相关性分析显示,十二指肠Claudin-3、Occludin基因与GSH/GSSG、MyD88、NF-κB、TLR4、IL-2等呈显著正相关(P0.01),与MDA显著负相关(P0.01)。空肠Claudin-3、Occludin基因与MyD88、NF-κB、TLR4、TLR6等基因显著正相关(P0.01),与MDA显著负相关(P0.01)。说明蛋氨酸替代物可能通过影响肠道氧化还原状态以及肠道菌群从而调节TLRs的表达,并通过TLRs传递信号激活MyD88、NF-κB等基因,最终影响TJ相关蛋白Claudin-3、Occludin以及AvBDs、细胞因子等的表达。本研究主要结论为：1)蛋氨酸限制与蛋氨酸羟基类似物均能提高鸡肠道TJ相关蛋白Claudin-3、Occludin基因表达。2)蛋氨酸羟基类似物能够缓解肠道氧化应激,提高其抗氧化能力,并且效果优于蛋氨酸限制。此外,肠道抗氧化能力的增强与TJ蛋白表达上调有关。3)蛋氨酸羟基类似物能够激活TLR-MyD88/NF-κB-β-防御素信号系统,是其上调TJ蛋白表达的原因之一。4)调节肠道菌群构成是蛋氨酸羟基类似物有别于蛋氨酸限制的特征,促进乳杆菌、双歧杆菌增殖是其上调TJ蛋白表达的原因之一。本研究对阐明MR影响TJ相关蛋白表达机制和提出利用蛋氨酸羟基类似物改善肠道功能的营养措施具有一定理论和应用价值。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R574.62

【参考文献】