Tim-3对炎性肠病的调节作用及机制研究

发布时间：2020-07-16 06:14

【摘要】： Tim-3对炎性肠病的调节作用及机制研究 背景 T细胞免疫球蛋白及粘蛋白分子-3(T cell Immunoglobulin domain and Mucindomain protein-3,Tim-3)是一种最初发现于活化的Th1细胞表面的共刺激分子,在结构上属于T细胞免疫球蛋白及粘蛋白(Tim)家族成员。Tim-3分子在维护体内免疫平衡稳定中起重要作用。现已知半乳糖结合蛋白-9(Galectin-9,Gal-9)为Tim-3的天然配体,该分子广泛表达于外周免疫系统,而其长片断的Gal-9亚型分子则特异性表达在肠粘膜及相关淋巴组织,二者均可与Th1细胞上的Tim-3分子特异性结合,引发Th1细胞死亡,下调Th1型免疫反应,诱导免疫耐受。目前已明确Tim-3分子通过调节不同CD~(4+)T效应细胞亚群的功能广泛参与了自身免疫病、移植排斥、抗感染等免疫应答过程。而Tim-3是否参与了炎性肠病(InflammatoryBowel Diseases,IBD)的发生,在炎性肠病中起到什么样的作用目前还不清楚。 目的 探讨Tim-3分子对炎性肠病的调节作用及机制。 方法 利用分子生物学技术克隆Tim-3胞外段基因,构建含有小鼠Tim-3胞外段基因的Tim-3_pET32a(+)重组质粒,转化表达菌株E.coli BL-21(DE3)感受态细胞,诱导表达目的蛋白,用镍柱亲和纯化目的蛋白,通过SDS-PAGE和Western blot方法验证目的蛋白的纯度和特异性。通过直肠灌注三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid,TNBS)的方法建立炎性肠病小鼠模型—TNBS-结肠炎,从体重、死亡情况,结肠大体及组织学改变和细胞因子变化等方面对模型进行评价。在TNBS-结肠炎小鼠的基础上腹腔注射Tim-3蛋白,从体重、死亡情况,结肠大体及组织学改变等方面观察Tim-3蛋白对结肠炎小鼠的影响。通过ELISA检测IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-23、TGF-β水平的变化,通过FACS检测小鼠外周血中Tim-3~+细胞的表达和小鼠脾细胞、肠系膜淋巴结中Treg细胞的表达及共刺激分子CD28、CD80、CD86、CTLA-4的表达,通过Real-time PCR法检测小鼠脾细胞和淋巴结细胞中Tim-3和Foxp3的表达。 结果 成功克隆了小鼠Tim-3基因及其胞外段基因片段;实现了小鼠Tim-3分子的可溶性原核表达。成功建立了炎性肠病小鼠模型,表现在建模后小鼠出现松毛、精神萎靡、少食、腹泻、体重下降、死亡等症状;结肠缩短、肠壁增厚,水肿、炎性渗出,呈节段性炎性改变;结肠发生透壁性炎症,肠壁结构破坏,大量炎性细胞浸润;IFN-γ水平升高、IL-4水平降低,IL-17水平升高,小鼠出现Th1、Th17细胞偏移;前炎性因子TNF-α、IL-6水平明显升高。在TNBS-结肠炎建模前12hr腹腔注射Tim-3蛋白能够明显加重小鼠结肠炎症状,表现在小鼠体重明显下降和死亡率明显增加,结肠大体标本和组织切片结果均提示结肠炎小鼠病理损伤进一步加重,并且结肠炎症状与小鼠体内Tim-3~+细胞数目成正相关;前炎性因子IFN-γ、IL-17、IL-23水平明显升高,而抗炎性因子IL-4、TGF-β水平明显下降;经典的Treg细胞群即表达CD25、Foxp3的CD4~+T细胞数目减少;肠系膜淋巴结细胞CD80的表达水平下降,同时CD4~+T细胞CTLA-4的表达降低而CD28的表达升高。 结论 Tim-3分子可能通过对共刺激分子CD28、CD80、CTLA-4的调节,影响CD4~+T效应细胞不同亚群的极化,发挥对炎性肠病的负调节作用。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R574
【图文】：

由于N端融合了Trx蛋白和(His)6标签，所以Tim一3蛋白产物的分子量约为37KDa。用构建正确的Tim一3一ET犯a(+)载体转化 E.cohBL一21(DE3)感受态细菌，图1一4显示了诱导表达后细菌上清和沉淀SDS一PAGE分析图谱，可见在37KDa处有明显的蛋白条带，与预测的分子量大小一致，并且初步提示Tim一3蛋白在上清中大量表达。图1一5显示了诱导表达后细菌上清和沉淀 WestemBlot鉴定分析图谱，可见在37KDa处有明显的特异性蛋白条带，并且确定了Tim一3蛋白主要在上清中表达。9466，24535262014_4图1一 4SDS一队GE分析Ti二3蛋白的表达:14.4KDa-94KDa蛋白Marker;2:.pet32a空载体诱导全菌;3:pet32a一Tim一3未诱导对照;4一6:pet32a-Tim一3诱导上清;7一9:pet32a一Tim一3诱导沉淀。 23456了89一…嘴鞘彝麟睽臀一3”确带一一一图1一 5westernBlot鉴定Ti二3蛋白的表达:14.4KDa一94KDa蛋白Marker;2:pet32a空载体诱导全菌;3:pet32a一Tim一3未诱导对照:4一6:pet32a-Tim一3诱导上清;7一9:pet32，Tim一3诱导沉淀。

37KDa处有明显的特异性蛋白条带，并且确定了Tim一39466，24535262014_4图1一4SDS一队GE分析Ti二3蛋白的表达KDa蛋白Marker;2:.pet32a空载体诱导全菌;3:pet32a一Tim一3未4一6:pet32a-Tim一3诱导上清;7一9:pet32a一Tim一3诱导沉淀。

由于N端融合了(His)6标签，所以采用镍柱纯化目的蛋白。在实验中分别用10mM、 50mM、 100mM、 200mM、 500mM咪哇进行梯度洗脱，收集各阶段洗脱峰进行SDS一队GE检测，图1一6显示了镍柱纯化后各阶段洗脱峰分析图谱，在 100n1M咪啤后半部分洗脱液、 200mM咪哇洗脱液、 500mM咪吟洗脱液中含有纯度较高的目的蛋白。用抗小鼠的Tim一3特异性抗体对纯化后获得的Tim一3蛋白进行 WesternBlot鉴定，图1一7显示了Tim一3蛋白特异性检测的 WesternBlot图谱，第1、2泳道可见在37KDa处有特异性的目的条带。 234567891094662舀)交父岁仁笆钾毅欲扮石钻派扁二节爵瀚繁臀~“’ 556 432烹黔嘿黔嘿黔一..脚..，......祠.自目幼....曰，加一图1一6镍柱纯化后各阶段洗脱峰分析图谱:14.4KDa一94KDa蛋白Marker;2:上样前;3:上样后;4:10mM咪哇洗脱; 5:50mM咪哇洗脱;6一 8:100mM咪哇洗脱 :9:200mM咪哇洗脱 ;10:500mM咪l些洗脱。 234537K0...曲户赫愧曝月口.门协34KD25KD书gKD图1一 7Tinr--3蛋白特异性检测的WesternBlot图谱一2:Tim一3蛋白;3:阴性对照;4:空白对照 ;5:14.4KDa一94KDa蛋白Markero

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 张胜桃;刘晓军;何培根;金霞;雷小妹;李守新;胡绍先;龚非力;杨东亮;;人TIM-3的克隆表达及其单克隆抗体的制备[J];中华风湿病学杂志;2005年12期

2 耿少霞;李育蓉;侯春梅;王会会;张及禄;韩根成;沈倍奋;马远方;黎燕;;Tim-3对巨噬细胞功能的调节作用研究[J];军事医学科学院院刊;2010年06期

3 马德强;郝友华;刘敏;徐春利;郭艳;陈悦;陆孟吉;杨东亮;;小鼠TIM-3原核表达载体的建立及多克隆抗体的制备与鉴定[J];中国免疫学杂志;2011年02期

4 骆雨;石炳毅;;TIM-3与器官移植免疫耐受的研究现状[J];军医进修学院学报;2010年07期

5 汪峰;孙自镛;朱旭慧;廖亚龙;汪月;刘彩林;;Tim-3在CD8~+ T细胞上的表达及功能研究[J];现代免疫学;2010年06期

6 邹晓清;阳大庆;顾小红;;乙肝患者PBMCs中Foxp3和Tim-3表达及IFN-γ分泌的变化[J];实用预防医学;2011年07期

7 陆小霞;胡维琨;熊盛道;熊维宁;徐国鹏;;哮喘患者诱导痰炎性细胞中Tim-3 mRNA表达的研究[J];华中科技大学学报(医学版);2009年03期

8 孙燕;张怡;;负性共刺激分子与自身免疫病[J];国际免疫学杂志;2006年01期

9 汪峰;陈忠华;;Tim-3,一个Th1相关的免疫调节分子[J];现代免疫学;2007年02期

10 张胜桃;刘晓军;金霞;何培根;龚非力;杨东亮;;TIM-3 mRNA在外周血单个核细胞不同细胞亚群及活化的T细胞上的表达[J];中华微生物学和免疫学杂志;2006年05期

相关会议论文 前5条

1 武其文;浦春;方芳;;变应性哮喘患者外周血单个核细胞Tim-1及Tim-3的表达及意义[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年

2 徐金瑞;杨易;张东涛;孙晶莹;;Tim-3基因4个SNP位点多态性与宁夏地区回族人群类风湿性关节炎相关性研究[A];北方遗传资源的保护与利用研讨会论文汇编[C];2010年

3 黄金波;崔天盆;王琳;陈凤花;时杰;胡丽华;;Tim-3与再生障碍性贫血的相关性研究[A];第四届全国临床检验学术会议论文汇编[C];2006年

4 王莹;马春红;;SLE患者外周血单个核细胞Tim-1及Tim-3基因的表达[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年

5 许朝旭;张桂梅;黄波;冯作化;;膜型Tim-3分子促进荷瘤小鼠抗肿瘤免疫应答的研究[A];湖北省暨武汉市生物化学与分子生物学学会第八届第十七次学术年会论文汇编[C];2007年

相关博士学位论文 前7条

1 李文先;TIM-1和TIM-3血清水平和基因多态性与系统性红斑狼疮的相关性研究[D];安徽医科大学;2011年

2 鞠瑛;Tim-3在HBV慢性感染中的表达及作用研究[D];山东大学;2009年

3 赵地;Tim-3在慢性HBV感染介导的CD8~+T细胞耗竭中的作用及其负调控机制的研究[D];山东大学;2012年

4 周晓曦;跨膜型TNF-α白血病细胞的标志物和抗体治疗靶点Tim-3未知配体的寻找及其功能的初探[D];华中科技大学;2012年

5 何文涛;阻断天然免疫Tim-3信号或TLR信号促进移植耐受诱导[D];华中科技大学;2010年

6 侯楠;Tim-3调控单核/巨噬细胞和NK细胞参与动脉粥样硬化的研究[D];山东大学;2010年

7 刘嵘;TIM-3对人气道上皮细胞株16HBE的NF-κB及炎症相关因子表达水平调控的研究[D];华中科技大学;2010年

相关硕士学位论文 前10条

1 由俊宇;Tim-3在急性高血压脑出血后炎症反应中的作用研究[D];山东大学;2011年

2 李霞;Tim-3对炎性肠病的调节作用及机制研究[D];河南大学;2009年

3 张利;Tim-3在自然流产免疫耐受中的作用研究[D];华中科技大学;2011年

4 王培;Tim-3在外周血单个核细胞上的表达及其在类风湿关节炎高活动度患者中的病理意义[D];华中科技大学;2011年

5 孙士静;半乳糖凝集素-9及其受体Tim-3在小鼠病毒性心肌炎中的动态变化及意义[D];山东大学;2011年

6 刘晓;Tim-3调节巨噬细胞极化及其对肝癌细胞的生长的影响[D];山东大学;2012年

7 籍增洋;Tim-3在强直性脊柱炎中的表达及肾痹汤的临床疗效观察[D];山东中医药大学;2011年

8 王晓;系统性红斑狼疮初发患者外周血TIM-3及其配体Galectin-9表达水平和意义[D];山东大学;2011年

9 钟玫君;Tim-3信号通路在小鼠实验性结肠炎中的作用[D];南昌大学;2012年

10 王燕;新疆地区维吾尔族、汉族Tim-3基因多态性与变应性鼻炎的关联性研究[D];新疆医科大学;2011年

本文编号：2757637