胆囊胆固醇结石形成过程中NHE3功能失调的机制研究

发布时间：2020-07-18 12:37

【摘要】：目的:胆囊结石是严重影响人们健康和生活质量的疾病。由于饮食结构的改变,胆囊结石的发病率明显升高。尽管胆石成因的研究有了较大进展,但其形成机制仍不十分明了。国内外学者对此进行了大量研究,发现胆囊浓缩功能增强,胆汁中胆固醇、钙离子及粘蛋白等促成石成份浓度增高是结石形成的重要诱因。然而,胆囊本身作为与疾病发生和发展有密切关系的器官,其重要性并未引起足够的重视。胆囊是储存和浓缩胆汁的器官,其粘膜有很强的浓缩功能。胆囊胆汁的浓缩过程主要通过离子与水的吸收来实现,在此过程中Na+/H+交换蛋白3(Na+/H+exchanger isoform 3,NHE3)起着重要的作用。NHE是表达于粘膜上皮细胞的离子转运蛋白,其功能是将细胞外的Na+转运至胞内同时排出等量的H+,在调节水电解质和酸碱平衡中发挥重要作用。在胆囊上皮细胞,NHE3向细胞内转运Na+形成细胞内外的渗透压梯度,水分子则顺渗透压梯度进入细胞使胆囊内胆汁浓缩。来自Narins的一项重要研究结果表明,胆囊结石形成前期胆囊粘膜浓缩增强,NHE3的活性增高,而采用NHE3抑制剂amiloride则可以明显抑制粘膜吸收并降低结石形成率。该研究提示,NHE3功能增强导致胆囊浓缩增加是结石形成的重要诱因。但令人遗憾的是,胆囊上皮细胞NHE3活性调节机制及其功能失调在结石形成中的作用尚属未知。我们在以往研究基础上提出致石饮食导致的NHE3功能异常是胆囊浓缩功能增强的重要诱因。因此,本博士论文拟对胆囊胆固醇结石形成过程中NHE3功能失调的分子机制展开研究。研究方法:本研究以高胆固醇饮食构建C57BL/6小鼠胆囊胆固醇结石模型。采用RT-PCR检测正常饮食组以及致石组胆囊粘膜NHE3基因在转录水平的差异;采用Western blot检测两组胆囊粘膜NHE3蛋白的表达情况;采用免疫荧光检测胆囊组织中NHE3细胞内定位情况。为进一步研究胆固醇结石形成后NHE3活性失调的机制,我们采用Western blot检测两组胆囊粘膜PKCα、NHERF1以及ezrin蛋白的表达情况;采用免疫共沉淀检测NHE3与ezrin以及NHERF1的相互作用情况。为探索胆囊结石形成前期导致NHE3活性增强的分子机制,我们以鹅脱氧胆酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)和/或forskolin刺激胆管癌细胞,采用Western blot检测CDCA和/或forskolin对NHE3、PKCα以及ezrin蛋白的表达影响;采用免疫共沉淀检测CDCA对NHE3与ezrin相互作用的影响。结果:结果显示,正常饮食组C57BL/6鼠胆囊胆汁清亮,呈现淡黄色,无结石形成,成石率为0。致石组所有C57BL/6鼠胆囊胆汁稠厚,可见颗粒状结石,呈黄白色,多发,成石率为100%。RT-PCR显示胆固醇结石组小鼠胆囊组织中NHE3基因的转录水平显着高于正常组(P0.05)。与正常组相比,致石组小鼠的胆囊组织中总NHE3在蛋白表达水平没有明显差异。NHE3在蛋白质和基因转录水平之间的差异可能是蛋白质的稳定性下降或NHE3 mRNA翻译减少的结果。因为磷酸化可以影响NHE3的转运活性,我们进一步检验了PS552-NHE3的水平。我们发现致石组小鼠胆囊组织中NHE3的磷酸化水平显着高于正常组(P0.05),与胆囊粘膜浓缩功能异常的现象吻合。胆囊粘膜的单层柱状上皮细胞表达NHE3和PS552-NHE3。NHE3蛋白在顶膜和细胞质中均有表达,这与NHE3可以在细胞顶质膜与细胞内之间转运的报道一致。此外,致石组和正常组之间总NHE3蛋白表达没有显着差异。胆固醇结石胆囊组织中NHE3的磷酸化水平明显增高。这些结果与我们的western blot结果一致。致石组小鼠的胆囊组织中总ezrin表达水平没有明显差异,但是ezrin蛋白的磷酸化水平显著增高(P0.05)。并且,PKCα以及NHERF1在蛋白表达水平增高(P0.05)。用NHE3抗体与胆囊粘膜上皮细胞总蛋白进行免疫沉淀,转膜后通过ezrin抗体进行免疫印迹分析。结果表明,NHE3免疫沉淀复合物中含有ezrin蛋白。用ezrin抗体与胆囊粘膜上皮细胞总蛋白进行免疫沉淀,转膜后通过NHE3抗体进行免疫印迹分析。结果表明,ezrin免疫沉淀复合物中含有NHE3蛋白。用NHE3抗体与胆囊粘膜上皮细胞总蛋白进行免疫沉淀,转膜后通过NHERF1抗体进行免疫印迹分析。结果表明,NHE3免疫沉淀复合物中含有NHERF1蛋白。用NHERF1抗体与胆囊粘膜上皮细胞总蛋白进行免疫沉淀,转膜后通过NHE3抗体进行免疫印迹分析。结果表明,NHERF1免疫沉淀复合物中含有NHE3蛋白。上述免疫共沉淀实验显示NHE3能够与NHERF1以及ezrin结合并形成蛋白复合体。在PKA激动剂forskolin的协同作用下,CDCA可以明显增强NHE3活性抑制因子PKCα的表达(P0.05),并活化细胞骨架连接蛋白ezrin(P0.05)。同时,CDCA能够促进ezrin与NHE3形成蛋白复合体。结论:高胆固醇饮食诱导的C57BL/6小鼠胆囊胆固醇结石这一动物模型成石率高并且经济可靠,可用于胆石成因的实验研究。胆囊结石形成后NHE3的磷酸化水平增高,与胆囊浓缩功能减退的现象相吻合,同时也提示NHE3功能异常与PKA信号通路活性的异常有关。在胆囊粘膜上皮细胞,NHE3同时表达于细胞膜和胞质内,这提示NHE3在细胞内的转运是调节其离子交换活性的重要机制。胆囊结石形成后粘膜浓缩功能减弱可能与ezrin,PKCα以及NHERF1表达异常导致的NHE3功能紊乱有关。胆囊组织中NHE3蛋白复合物的形成是调控其离子交换活性的重要机制之一。胆囊粘膜浓缩功能异常很可能是其暴露于致石胆汁的后果。生理状态下,CDCA很可能对胆囊上皮细胞NHE3的活性具有抑制作用;致石胆汁中CDCA浓度减低可能是结石形成前期胆囊粘膜浓缩功能增强的重要诱因。通过本项目的系统研究,能够加深对胆囊结石发病机理的理解,为预防和治疗胆囊胆固醇结石提供理论依据和实验基础。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575.62
【图文】：

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中国医科大学博士学位论文石率观察：CON 组 C57BL/6 鼠胆囊胆汁呈现淡黄色，清亮，无石率为 0（0/18）。LITH 组所有 C57BL/6 鼠胆囊内可见颗粒 1.3），胆囊胆汁稠厚，成石率为 100%（17/17）。

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LITH组胆囊，小鼠胆囊内可见颗粒状黄白色结石，胆囊胆汁稠厚

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.4. RT-PCR 显示胆固醇结石组胆囊中 NHE3 mRNA 表达显着高于正常醇结石形成后 NHE3 总蛋白及磷酸化水平的改变。定胆囊吸收功能的降低是否由 NHE3 表达改变导致，采用 we果显示，与对照组相比，致石组小鼠的胆囊中总 NHE3 蛋白表异（图 1.5）。 NHE3 在蛋白质和基因水平表达之间的差异可性下降或 NHE3 mRNA 翻译减少的结果。因为磷酸化可以影响换活性，我们进一步检验了 PS552-NHE3 的水平。我们发现致中 NHE3 的磷酸化显着高于对照组，差异有统计学意义(P < 0述结果表明，NHE3 磷酸化水平的改变可能导致其离子交换活表达的增加也与胆囊结石形成后胆囊浓缩功能降低的现象一致

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