乙型肝炎病毒X基因转染诱导大鼠肾小球系膜细胞增殖及上调促炎因子表达的机制

发布时间：2020-07-24 05:41

【摘要】： 第一部分乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建目的：构建乙型肝炎病毒(HBV)X基因与pCI-neo相融合的高效真核表达载体，为进一步研究HBV X基因的功能奠定基础。方法：设计并合成HBV X基因的引物，以HBV DNA阳性血清PCR扩增得到HBV X基因全序列，将X基因连接到真核表达载体pCI-neo，构成pCI-neo-X质粒，然后用酶切图谱分析、PCR检测和扩增产物序列分析等方法，鉴定所构建的真核表达载体。结果：以重组载体为模板扩增得到的片段大小与已知HBV X基因大小相同，酶切也得到目的基因片段，测序结果也显示与已知X基因序列相同。结论：成功构建了HBV X基因的真核表达载体，为进一步研究HBVX基因的功能奠定了基础。第二部分乙型肝炎病毒X基因转染对大鼠肾小球系膜细胞增殖以及肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β和白细胞介素-6表达的影响目的探讨HBV X基因表达的蛋白(HBx)对体外培养的大鼠系膜细胞表达肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6及细胞增殖的影响。方法将前面构成的pCI-neo-X真核表达载体，采用脂质体法将pCI-neo-X转染给体外培养的大鼠系膜细胞，Westem blot测定HBx的表达；以半定量反转录(RT)-PCR测定体外培养大鼠系膜细胞TNF-αmRNA、IL-1βmRNA、IL-6 mRNA表达；酶联免疫吸附试验(ELISA)测定培养上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6。甲基噻唑基四唑(MTT)法测定细胞增殖。结果转染pCI-neo-X的系膜细胞，HBx在36和48小时表达明显。同时半定量反转录PCR测定显示TNF-αmRNA、IL-1βmRNA、IL-6 mRNA表达量较未转染和转染空载体组明显增高。培养36和48小时后上清液中TNF-α水平在转染pCI-neo-X组、未转染和转染空载体组分别为(185．3±70．7)pg／ml，(41．7±10．3)pg／ml，(44．0±10．1)pg／ml，(140．3±42．1)pg／ml，(43．7±10．6)pg／ml，(33．3±8．6)pg／ml；IL-1β水平分别为(402±60)pg／ml，(182±23)pg／ml，(170±18)pg／ml，(432±58)pg／ml，(181±20)pg／ml，(165±19)pg／ml；IL-6水平分别为(177．0±18．2)pg／ml，(85．7±16．9)pg／ml，(69．7±22．2)pg／ml，(179．7±26．3)pg／ml，(70．0±18．3)pg／ml，(73．0±14．0)pg／ml，pCI-neo-X组与未转染和转染空载体组比较，均有显著性差异(p＜0．05)；细胞增殖在36和48小时pCI-neo-X组最明显，吸光度分别为1．56±0．36，1．69±0．32，与未转染组0．70±0．08，0．74±0．18和转染空载体组0．68±0．18，0．80±0．19比较，有显著差异(p＜0．05)。结论HBx可诱导大鼠系膜细胞高表达TNF-α、IL-1β和IL-6，促进系膜细胞增殖。HBx对系膜细胞的增殖作用可能与TNF-α、IL-1β、IL-6的高表达有关。第三部分乙型肝炎病毒X蛋白通过激活核因子-κB和细胞外调节蛋白激酶上调大鼠系膜细胞表达肿瘤坏死因子-α 目的探讨HBV X基因转染大鼠系膜细胞导致细胞增殖及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)高表达的细胞外蛋白调节激酶(ERK)信号转导机制。方法将含有HBVX基因的质粒pCI-neo-X转染入体外培养的大鼠系膜细胞，MTT法检测系膜细胞增殖，半定量RT-PCR检测TNF-αmRNA表达，ELISA检测培养上清液中TNF-α表达。Western blot检测HBx、ERK_(1/2)及p-ERK_(1／2)表达。分别采用特异性抑制剂U0126阻断ERK_(1/2)通路，Lactacystin阻断NF-κB通路和SB203580阻断p38MAPK通路，观察培养细胞增殖、TNF-α及其mRNA表达，以不加抑制剂作为对照。结果转染pCI-neo-X后，系膜细胞增殖明显，细胞TNF-αmRNA及上清液TNF-α表达均增高，通过阻断ERK_(1／2)或NF-κB通路，系膜细胞增殖减弱，细胞TNF-αmRNA及上清液TNF-α表达均下降。而阻断p38MAPK通路对系膜细胞增殖，细胞TNF-αmRNA及上清液TNF-α表达无明显影响。结论转染HBV X基因可促使系膜细胞增殖，细胞TNF-αmRNA及上清液TNF-α表达均增高，这一作用可能部分是HBV X基因表达的蛋白通过激活ERK_(1／2)以及NF-κB通路信号而实现。而与p38MAPK通路无关。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R512.62;R692.3
【图文】：

引物,线性模式,限制性内切酶,PCR扩增

叉叉叮口 !!!鬓鬓鬓三三‘夕众 lll图2:pcl一neo一HBx载体构建流程图 T7TranseriPtionStart5’二丁币勺幼认CGACTCACI乎习 -AGGCT户GCCTCGAGAA耳CACGCGTGG丁 T7Promoter尹动户}厂力0!石COR!}l八刃汀}图3:酶切位点线性模式图二、PCR扩增X基因用常规PCR方法扩增X基因，以HBV基因组DNA为模板，引物如下，上游引物5’一CCGCTCGAGGTATACATCATTTCCATGGC一3’下游引物5’一CCGGAATTCGAGATGATTAGGCAGAGGTG一3，分别在上游引物和下游引物5’端添加限制性内切酶Ec口Rl和肠口I酶切位点。】7

琼脂糖凝胶电泳,产物,凝胶电泳,特异性

72℃ 10min 4OCIOhrsPCR产物用低熔点琼脂糖凝胶电泳，结果在50Obp处有特异性条带。如图4。500bP一~464bP图4:PCR产物琼脂糖凝胶电泳18

酶切图,酶切图,亚型

CI一neo一X酶切图转化感受态细胞DH5a后选的基因片段后送上海英骏生基因adw亚型序列一致。比对结果:TGTGCTGCCAACTGGATCCTGCGCGGGATGTGCTGCCAACTGGATCCTGCGCGGGA

【参考文献】