O-GlcNAc水解酶OGA在溃疡性结肠炎中的作用和机制研究

发布时间：2020-07-30 07:29

【摘要】：背景和目的:异常的O-Glc NAc糖基化修饰与炎症相关性疾病关系密切。在OGA肠上皮特异敲除(OGA intestine-specific knockout,OGA-IKO)小鼠模型的基础上探讨OGA对溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)的作用及机制。方法:1.溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)患者样本收集:尊重患者意愿并签署知情同意书,在结肠镜下用活检钳钳取溃疡和远离病灶的正常黏膜组织各2-3块。采用Western Blot和免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)的方法观察OGA、OGT和O-Glc NAc蛋白在UC和正常结肠黏膜组织中的表达情况。2.利用Cre/Lox P重组酶系统,将OGA-Flox小鼠和OGA-Kin小鼠分别与VilinCre工具小鼠进行交配以构建OGA-IKO和OGA-IKI小鼠模型。3.采用葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulfate Sodium,DSS)溶液自由饮水的方法对8-10周龄小鼠进行结肠炎诱导,观察OGA-IKO小鼠和同窝对照OGA-Flox小鼠的结肠炎表型,通过HE和q RT-PCR结果评价小鼠结肠组织损伤和炎症程度。4.采用慢病毒转染技术在人正常结肠上皮细胞系(NCM460)中构建OGA敲减和过表达的细胞系。5.采用流式细胞技术观察OGA敲减后对细胞周期和凋亡的影响;在透射电镜下观察OGA敲减后对NCM460细胞系和小鼠结肠上皮细胞超微结构的影响;探讨OGA敲减后内质网应激相关蛋白的变化及其参与结肠炎症的潜在机制。6.基于16S r DNA测序技术,探究OGA肠上皮特异敲除对小鼠肠道菌群多样性和主要物种丰度的影响,并分析OGA肠上皮特异敲除通过改变肠道菌群影响UC的潜在机制。结果:1.相对于正常结肠黏膜,溃疡性结肠炎黏膜组织中OGA、O-Glc NAc和OGT蛋白的表达水平均明显升高。2.成功构建了OGA-IKO和OGA-IKI小鼠模型。Western Blot验证发现在OGAIKO小鼠肠道组织中OGA表达水平明显降低,总体O-Glc NAc水平升高,同时OGT表达水平代偿性降低;在OGA-IKI小鼠肠道组织中OGA表达水平升高,但未观察到O-Glc NAc和OGT水平有明显改变。同样通过免疫组化的方法也分别观察到OGA表达水平的降低和升高。3.对小鼠进行结肠炎诱导后,观察发现OGA-IKO小鼠对DSS诱导结肠炎的敏感性降低。与OGA-Flox小鼠相比,OGA-IKO小鼠体重下降比例、炎症活动指数及结肠缩短程度均低于对照组,差异具有统计学意义。DSS造模小鼠结肠的HE染色结果显示:相对于野生对照小鼠,OGA-IKO小鼠结肠上皮损伤程度较轻,结肠黏膜破坏范围较小,炎性细胞浸润也相对不明显。q RT-PCR检测小鼠结肠样本,结果显示:OGA-IKO组小鼠炎症因子TNFα、IL-6和IL-1β表达水平均低于对照组,提示结肠上皮中OGA的缺失在DSS诱导的结肠炎中发挥保护作用。4.成功构建了OGA敲减和过表达的NCM460细胞系。OGA敲减和过表达的细胞系中OGA、OGT和O-Glc NAc变化与OGA-IKO和OGA-IKI结果一致,即:OGA敲减后细胞系中OGA表达水平降低,总体O-Glc NAc水平升高,OGT表达水平代偿性下降;在OGA过表达的细胞系中OGA表达升高明显,同样未观察到O-Glc NAc和OGT的蛋白水平发生明显改变。5.OGA敲减后细胞凋亡比例明显增加,细胞周期未发生明显变化,内质网增生明显,细胞微绒毛形态和长度、细胞间连接,线粒体、细胞核等亚细胞结构无明显改变;进一步实验结果显示内质网应激(ER Stress)相关蛋白PERK和Calnexin的表达水平下降,而CHOP蛋白表达水平升高。提示OGA缺失可能通过影响内质网功能从而参与调控结肠的炎症反应。6.通过对12周龄的OGA-IKO和OGA-Flox小鼠进行肠道菌群16S r DNA测序发现OGA-IKO小鼠的菌群多样性增加,菌群的构成也发生了明显改变,已知有抑制炎症作用的毛螺菌(Lachnospiraceae)丰度显著增加,与炎症正相关的细菌韦荣球菌(Veillonellaceae)和Negativicute丰度显著下降。提示OGA肠上皮缺失通过改变菌群结构抑制肠道炎症。结论:肠上皮OGA特异敲除在结肠炎中发挥保护作用。小鼠肠上皮OGA特异敲除能减轻DSS诱导的结肠炎,进一步研究发现OGA缺失可能通过促进损伤细胞的凋亡、影响内质网功能和改变小鼠肠道菌群谱来参与结肠炎症反应。同时在临床样本中也证实了OGA、OGT和O-Glc NAc的蛋白表达水平与溃疡性结肠炎关系密切,这些发现为寻找治疗溃疡性结肠炎的靶点提供了新的思路。
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R574.62
【图文】：

结肠,不同部位,表达水平,代谢综合征

OGT 和 O-GlcNAc 在结肠不同部位的lcNAc 修饰被称为能量的 “感受器”，修饰的异常与代谢综合征的发生关系合征均与低程度的炎症反应密不可分炎症因子的异常激活。近年来对 O-G

序列,小鼠,ES细胞,显微注射

空军军医大学硕士学位论文2.1.2 OGA 肠上皮特异敲除小鼠的构建1）Ogaflox-Neo/+小鼠去除 Neo cassette获得条件性基因敲除小鼠带有正筛选标记 Neo cassette，Neo cassette 带有 polyA信号，因而得不到全长 mRNA。所以首先要在 F1 代小鼠中去掉 Neo cassette。Flp重组酶可以特异识别 Neo cassette 的 Frt 序列。将 F1 小鼠与带有 Flp-deleter 的小鼠进行交配，即得到带有 Flp 基因的 floxed（fl）小鼠（Flp-Floxed 小鼠）。具体策略如下图 4

小鼠,肠道,策略,过表达

图 5 Ogafl/fl小鼠与 Villin-Cre 鼠交配获得 OGA 肠道特异敲除小鼠策略。 A：交配策略；B:琼脂糖凝胶电泳鉴定基因型结果。2.1.3 OGA 肠上皮过表达小鼠的构建OGA 过表达的策略同样利用 Cre/Loxp 系统，利用基因和胚胎工程在 OGA 基因转录的终止子敲入突变（Kin）转录终止子失活，mRNA持续转录，从而实现 OGA过表达，根据其过表达的原理，DNA一条链带有 Kin位点 OgaKin+即可达到过表达目的,将 OgaKin+于同一背景的 Villin-Cre鼠交配获得 OgaKin+，Cre+小鼠即为 OGA肠上皮特异过表达小鼠。2.2 小鼠琼脂糖电泳基因型鉴定2.2.1 鼠尾 DNA 提取1）将 3 周龄的小鼠按性别分笼并剪尾，剪尾长度约 0.2-0.3CM，置于 1.5ml EP管中。2）每个 EP 管中加入 100ul 的 Buffer L 溶液和 2ul 的 Protease，离心混匀并保证

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