一种细菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331对溃疡性结肠炎的治疗作用及其机制研究

发布时间：2020-08-05 15:55

【摘要】：目的 溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是一种主要浸润黏膜及黏膜下层的慢性非特异性炎症性肠病，主要表现为腹痛、腹泻、黏液便和血便，并伴有多发性硬化症、视神经炎、骨质疏松等肠外表现。目前，UC的发病率有逐年升高的趋势，由于病因不清、发病机制不明确，临床上缺乏有效的治疗方法，治疗难度较大，已被世界卫生组织确定为现代难治病之一。进一步明确UC的发病机制，并研制新的防治药物已经成为UC研究中的重点和难点。CZLC331是一种细菌鞭毛蛋白衍生物，是5型Toll-like受体(TLR5)激活剂，对TLR5-NF-κB信号通路具有激活作用。研究发现，细菌鞭毛蛋白衍生物可以通过抗细胞凋亡和调节结肠组织TLR家族的表达水平等机制显著保护放射性小鼠胃肠道损伤。而目前认为，T淋巴细胞凋亡失衡是UC发病的重要环节。因此，我们提出一个设想，细菌鞭毛蛋白衍生物是否能够通过调节TLR家族的自然免疫、抗T细胞凋亡机制预防和治疗UC？本研究在成功建立小鼠UC模型的基础上，观察CZLC331对UC的治疗效果，并研究其发挥治疗作用的可能机制，对UC的病因及发病机制提出一系列证据，为研发一种治疗UC的新型药物打下基础。 方法 采用2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-Trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)溶液灌肠的方法建立小鼠UC模型，以灌胃针代替传统灌肠工具硅胶管，并进行相关技术改良和灌肠液剂量探索，使造模效率提高，模型稳定性增强；CZLC331治疗效果分析：小鼠摄食水量、便血量、皮毛光泽度等一般状态观察。拍照观察小鼠结肠组织黏膜和浆膜层变化。显微镜下观察小鼠结肠组织HE染色的病理改变。强迫游泳实验、悬尾实验、糖水偏爱实验观察小鼠的抑郁指数；CZLC331治疗机制研究：小鼠结肠组织提取RNA，RT-PCR方法测定小鼠结肠TLR1-4、6-9表达情况。ELISA试剂盒测定小鼠血清IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α水平。小鼠结肠提取蛋白，Western-blot检测NF-κB的表达情况。 结果 成功建立了小鼠UC模型，UC小鼠均出现少食、少动、体重下降、皮毛光泽度下降、腹泻、便血等现象，小鼠结肠充血、水肿、炎症、溃疡形成，病理检查发现结肠组织水肿、细胞排列紊乱、炎性细胞浸润、杯状细胞缺失、溃疡形成。造模过程中以灌胃针代替传统造模工具硅胶管，利用麻醉机代替传统的麻醉方法，同时进行相关技术改进和灌肠液剂量探索，取得较好的灌肠效果，减少灌肠过程中的溢液现象，使造模效率提高，模型稳定性增强。 治疗结果发现，细菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331对UC小鼠具有显著的治疗效果，治疗后小鼠的一般生理状态明显好转，便血、少食少动等现象有所减轻，摄食/水量、活动性明显增加，结肠黏膜层和浆膜层充血、水肿、溃疡、糜烂程度明显减轻，病理改变较模型组明显减轻，细胞排列结构比较整齐、少量杯状细胞消失及淋巴细胞和中性粒细胞浸。经CZLC331治疗后， UC小鼠抑郁程度较模型组明显减轻，但与对照组相比，仍存在抑郁表现：治疗组的强迫游泳不动时间为64.7±10.35s，显著低于模型组(86.7±15.96s，P 0.01)，显著高于对照组(21±5.25s，P 0.01)。治疗组小鼠悬尾实验不动时间为62.5±13.92s，显著低于模型组(111.3±41.11s，P 0.01)，显著高于对照组(16±8.34s，P 0.01)。治疗组小鼠糖水偏爱百分比66.5±7.29%，显著高于模型组(34.5±4.64%，P 0.01)，显著低于对照组(77.2±7.68，P 0.01)。 3.2mg/kg CZLC331蛋白在TNBS造模后4h腹腔注射治疗UC小鼠，TLR家族PCR条带的表达量显示与模型组相比具有明显的差异，与对照组相比，TLR1-4、TLR9模型组表达量明显上调(P0.05)，TLR6-8模型组表达量上调尤其显著(P0.01)；与模型组相比，TLR1的治疗组表达量明显下调(P0.05)，TLR2-4、TLR6-9的治疗组表达量下调尤其显著(P0.01)；腹腔注射CZLC331后治疗组血清抑炎因子水平多数下调：血清IL-4水平，治疗组(54.29±5.83ng/ml)、对照组(53.41±7.28ng/ml)、模型组(53.71±7.72ng/ml)两两比较均无统计学差异(P0.05)。血清IL-10水平，模型组(59.36±14.46ng/ml)与对照组(91.48±24.38ng/ml)相比明显降低(P0.05)，治疗组(54.29±5.83ng/ml)与模型组相比无统计学差异(P0.05)，但升高趋势明显，治疗组和对照组之间无统计学差异(P0.05)；血清促炎因子IL-6水平模型组(47.10±15.72ng/ml)和治疗组(48.34±8.20ng/ml)与对照组(41.48±6.33ng/ml)相比，浓度明显升高，具有统计学差异(P 0.05)，模型组和治疗组之间无统计学差异(P0.05)。促炎因子IL-8因选取唯一时间点变化不明显，故选择造模后12h、24h、36h、48h分别测定血清IL-8浓度变化，模型组造模12h后血清IL-8水平(42.85±6.39ng/ml)，与对照组相比(36.37±3.52ng/ml)明显升高，具有统计学差异(P 0.05)，与模型组造模后24h(31.63±2.24ng/ml)、36h(32.03±5.12ng/ml)、48h(28.88±3.79ng/ml)比较，明显升高，具有统计学意(P 0.05)，治疗组造模后12h(35.72±6.06ng/ml)、24h(28.38±7.57ng/ml)、36h(29.63±7.57ng/ml)、48h(29.28±4.15ng/ml)血清IL-8水平，两两比较无统计学差异(P0.05)，且整体水平低于模型组；血清肿瘤坏死因子水平治疗组(192.50±63.85ng/ml)与对照组(173.86±29.26ng/ml)相比明显升高，模型组(140.11±12.70ng/ml)与对照组相比明显降低，比较均具有统计学差异(P 0.05)，其治疗组升高可能与CZLC331激活TLR5-TNF通路有关；Western-blot检测小鼠结肠NF-κB表达情况发现：腹腔注射CZLC331能明显下调UC模型组NF-κB蛋白的表达量。 结论 利用TNBS溶液灌肠方法成功建立了UC小鼠模型，利用灌胃针代替硅胶管作为灌肠器材，并进行一系列技术改良，经改进后的小鼠UC造模方法，造模效率高，模型重复性好，稳定性高。细菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331对UC小鼠具有显著的治疗效果，UC小鼠一般生理状态、结肠黏膜损伤程度，病理改变及抑郁状态均显著改善。TLR家族，TLR5-NF-κB-TNF-α通路，白介素4、10等促炎因子均参与UC的形成。CZLC331对UC治疗效果可能与其调控TLR家族成员表达，CZLC331降低体内促炎因子水平，升高体内抑炎因子水平，增加肠道NF-κB蛋白表达以及对TLR-NF-κB-TNF-α通路的调控等作用密切相关。
【学位授予单位】：辽宁医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R574.62

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本文编号：2781706