载基因超声微泡造影剂治疗肝纤维化的实验研究

发布时间：2020-08-09 13:01

【摘要】： 肝纤维化是慢性肝病共有的病理改变,其本质是以胶原为主的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)合成增多,而降解相对减少,两者失去动态平衡,致使过多的ECM沉积于肝内,同时伴有肝实质的广泛破坏和再生,导致肝小叶和肝血管结构的紊乱,最终可引起肝功能失代偿、腹水、上消化道出血等一系列并发症。肝纤维化在进入肝硬化前尚可逆转,因此人们十分重视肝纤维化的研究,特别是基础研究已取得较大的进展,已可从基因水平上认识肝纤维化的治疗。目前,常用的一般方法是将足够的治疗性基因导入受损的肝脏,使外源性基因得到表达调控,达到延缓和治愈肝纤维化的目的。针对肝纤维化的形成机制,其基因治疗途径主要包括抑制HSC的活化、促进ECM降解、抑制间质炎症反应和促进肝细胞增生。目前,主要是在肝脏受到慢性损伤刺激或发生纤维化后,针对肝纤维化发生的某些环节,即针对特定的细胞因子,在体细胞基因水平进行调控,以达到阻止肝纤维化病理进展的目的。肝纤维化基因治疗针对的重要因子包括:转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、表皮生长因子(epidermal growthfactor,EGF)、角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor, KGF)、肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration, ALR)、白细胞介素(interleukin ,IL)和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)、基质金属蛋白酶抑制剂(inhibitors of MMP ,TIMP)等。肝细胞生长因子(HGF)可以作为肝纤维化基因治疗的一种手段。HGF主要由间质细胞衍生的多功能因子,通过自分泌或旁分泌的方式作用于上皮源性的细胞,诱导细胞有丝分裂、促进细胞移动并且对抗细胞因子诱导的凋亡。HGF能调节胶原纤维的合成和炎性反应,在治疗创伤愈合、防止组织纤维化中起着重要的作用。因此,它在肝纤维化发病机制中的地位也越来越受到重视。尽管国内外学者已经做了许多努力,外源基因导入人体组织细胞的安全性和有效性尚难以令人满意,这也成为基因治疗应用于临床的主要障碍。目前主要有两类基因载体系统:病毒载体和非病毒载体,病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒等,非病毒载体包括质粒DNA、脂质体等。这两类载体有其各自的优缺点;病毒载体在基因转染效率方面有很大优势,但载体本身的安全性限制了其广泛应用;非病毒载体毒性小、无免疫原性,制剂可高度浓缩,但其基因转染效率远远低于病毒载体,且缺乏靶向性。为了寻找一种更安全、高效的基因转染方法,我们将超声微泡造影剂作为载体。超声微泡造影剂(以下简称微泡)是由类似红细胞大小的含气微泡组成,注入静脉后能到达红细胞所能到达的部位,使血流丰富的实质器官如心肌、肝脏、肾脏等在二维超声仪检测时产生较强对比显影。新近研究发现,超声靶向破坏微泡(ultrasound targeted microbubble destruction, UTMD)是增强基因转染的方式之一。微泡不但可以作为基因转染的远程靶向促进剂,在基因传输过程中保护基因;而且超声靶向破坏微泡(UTMD)产生的机械效应和空化效应可使细胞膜通透性增加,并致直径≤7μm的微血管破裂,内皮细胞间隙增宽,靶基因可通过破裂的微血管和内皮细胞间隙到达组织细胞内,同时微泡破裂产生的冲击波、射流作为一种驱动力量,可促使从微泡上释放出来的基因进入靶细胞达到靶向提高基因转染效率目的。因此,超声靶向破坏微泡(UTMD)具有安全无创、低免疫原性、可反复应用以及器官特异性和超声可到达靶器官的广泛适用性等诸多优势。基于以上理论,本课题通过制备载HGF基因的超声微泡造影剂,然后运用超声靶向破坏微泡(UTMD)介导HGF基因治疗大鼠肝纤维化,观察治疗后HGF基因在组织细胞内的表达情况及治疗效?果,为肝纤维化基因治疗提供一个新的途径和手段,为研究和评价超声靶向破坏微泡(UTMD)介导的肝脏基因转染提供可靠的实验依据。本课题研究主要包括以下三个部分的内容: 第一部分载基因脂质超声微泡造影剂的制备目的制备一种能高效载基因的脂质超声微泡造影剂,评价其物理性质、载基因能力和体内显影能力。方法采用层-层吸附(layer-by-layer,LbL)法将HGF基因和多聚赖氨酸(Polylysine ,PLL)分层吸附在自制的脂质超声微泡造影剂上,检测微泡的形态、分布、浓度、粒径、表面电位、载基因能力和体内显影能力。结果载PLL、载(PLL+DNA)和载(PLL+DNA+PLL)的微泡与空白微泡相比,其形态、浓度、粒径没有显著差异;而载(PLL+DNA+PLL+DNA)的微泡粒径增大,与空白微泡相比差异有统计学意义(p㩳0.05),但其仍然满足一般造影剂的要求;随着微泡载PLL和基因的层数增加,其表面电位向正或负反转;同时,随着载基因微泡外壳吸附基因的层数增加,载基因量也随之增加;体内造影实验结果显示,载(PLL+DNA+PLL+DNA)的微泡可增强兔肝实质显像,持续20 min以上。结论自制的载基因及PLL脂质超声微泡造影剂制备方法简单、载基因的效率高,可作为携带基因等生物活性物质的载体材料。第二部分超声辐照微泡介导肝细胞生长因子基因体外实验目的研究超声辐照超声微泡造影剂促进肝细胞生长因子(HGF)基因在大鼠肝星状细胞株(hepatic stellate cell ,HSC-T6)中的转染效果。方法将HSC-T6接种在24孔板中,随机分为以下5组:(1)空白对照组;(2)单纯质粒组;(3)载基因超声微泡造影剂组;(4)质粒+超声组;(5)载基因超声微泡造影剂+超声组。转染24h后,荧光显微镜及流式细胞仪检测pIRES2-EGFP/HGF在细胞内的表达及转染效率;MTT法检测该转染方法对HSC-T6生长活性的影响;Western Blot检测HGF蛋白的表达。结果载基因超声微泡造影剂+超声组的绿色荧光强度及转染率均高于其它各组,并对细胞活性无明显影响,且HGF蛋白的表达均高于各组(P0.05)。结论超声辐照超声微泡造影剂可提高基因在体外培养HSC-T6的转染效率,并对细胞活性无明显影响,该方法为提高非病毒载体的转染效率提供一个新策略。第三部分超声辐照微泡介导肝细胞生长因子基因治疗大鼠肝纤维化目的探讨超声辐照载肝细胞生长因子(HGF)的超声微泡造影剂治疗大鼠肝纤维化的可行性。方法将40只Wistar大鼠建成肝纤维化模型后随机分为5组,即①超声+载基因超声微泡造影剂组(HGF+US/MB),②超声+单纯质粒组(HGF+US),③质粒+超声微泡造影剂组(HGF+MB),④单纯质粒组(HGF),⑤单纯模型组(MA)。经股静脉注入超声微泡造影剂,同时超声基因转染治疗仪辐照肝区,辐照条件为300 KHz,2 W/cm2,辐照10 s,间隔10 s ,共20 min。于超声辐照后14 d行磁共振弥散加权成像(diffusion weighted imaging, DWI)检查;然后处死各组大鼠,取肝组织进行苏木精/伊红(hematoxylin/eosin ,HE)染色,观察肝纤维化恢复情况;病理切片行masson染色,免疫组织化学法(immunohistochemistry ,IHC)检测肝组织中I型胶原的表达,倒置显微镜观察胶原分布情况; Western Blot检测HGF蛋白在大鼠肝脏中的表达。结果HGF+US/MB组的表观弥散系数(apparent diffusion coefficient ,ADC)值明显高于其他各组;相反地,指数表观弥散系数( exponential apparent diffusion coefficient ,EADC)低于其他各组;病理切片HE染色,可见HGF+US/MB组汇管区纤维结缔组织增生,但肝小叶结构完整,其余各组纤维组织增生程度强于HGF+US/MB组,尤其在MA组,出现假小叶;masson染色结果与HE染色的结果一致;IHC结果显示,I型胶原被染成棕黄色, HGF+US/MB组明显少于其他各组,半定量计数为(0.1752±0.00398),与其他各组比较差异均有统计学意义(P0.05)。同时,HGF+US/MB组的HGF蛋白的表达均高于其他各组(P0.05)。结论超声靶向破坏微泡能够介导HGF基因在肝组织内高效表达,并产生抗纤维化效应,为肝纤维化的基因治疗提供一种新的基因转移途径。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R575.2
【图文】：

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图 1-1a 脂质超声造影剂光镜图片（×200）Fig.1-1a Light microscopy image of themicrobubbles (×200)图 1-1b 载 PLL 脂质超声造影剂光镜图片（×200）Fig.1-1b Light microscopy image of themicrobubbles carrying PLL (×200)

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26图 1-1c 载 PLL+DNA 脂质超声造影剂光镜图片（×200）Fig.1-1c Light microscopy image of themicrobubbles carrying PLL+DNA (×200)图1-1d 载PLL+DNA+PLL脂质超声造影剂光镜图片（×200）Fig.1-1d Light microscopy image of themicrobubbles carrying PLL+DNA+PLL(×200)

【参考文献】