sDR5-Fc改善小鼠急性溃疡性结肠炎的作用及机制研究

发布时间：2020-08-11 20:30

【摘要】：背景溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是由多因素引起的以免疫紊乱和炎症细胞活化为明显特征的炎症性肠疾病,其中巨噬细胞的活化在疾病的发生发展中起到了重要的作用。NLRP3炎症小体的激活是巨噬细胞活化的主要形式之一,同时也是IL-1β炎症因子生成的主要来源。在长期的炎症条件下,结肠上皮细胞受损,细胞凋亡率明显上升,进一步加重疾病的进展。因此针对该病,抑制炎症反应和减轻结肠上皮的损伤是疾病治疗的主要策略。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是肿瘤坏死因子超家族II型跨膜蛋白,又称Apo2L,与其受体DR5(TRAIL-R2)结合以后除了可以引发肿瘤细胞的程序化死亡外,在某些条件下也可以诱导正常细胞的死亡。而且,DR5与TRAIL结合以后可以激活NF-κB、MAPK等通路,诱导炎症因子产生比如IL-1β、TNFα等,这暗示了TRAIL-DR5通路可能通过NLRP3炎症小体调控巨噬细胞活化,参与炎症的发生发展。在本研究中我们探讨了TRAIL是否通过NLRP3炎症小体调控巨噬细胞的活化,参与炎症。同时,我们利用sDR5-Fc融合蛋白阻断TRAIL-DR5通路观察其对小鼠急性溃疡性结肠炎是否具有改善作用。目的研究sDR5-Fc对小鼠溃疡性结肠炎的改善作用及机制。方法用3%的DSS建立小鼠急性溃疡性结肠炎模型,动物被随机分为六组,分别为Normal、DSS、hIgG、益赛普、sDR5-Fc 10 mg/kg、sDR5-Fc 20 mg/kg。每两天给一次药,每天给小鼠进行疾病活动性评分(disease activity index,DAI),主要包括体重下降、腹泻、出血三个方面。小鼠在建模的第六天处死,取全血,离心取上清,用于ELISA检测血清IL-1β的含量;取肠系膜淋巴结,流式细胞术检测巨噬细胞的改变;取整段结肠记录长度,并取远端一式三份,一份用于Western blot检测NLRP3炎症小体、各相关炎症因子的表达水平;另一份结肠组织用于实时荧光定量聚合酶链式反应RT-PCR检测NLRP3炎症小体和各相关炎症因子基因水平的改变;最后一份放4%多聚甲醛中固定,IHC检测结肠组织中巨噬细胞的变化,并连续切片对巨噬细胞和NLRP3进行了共定位,HE验证结肠组织病理改变和sDR5-Fc对小鼠心肝脾肺肾的安全性初步评价。在NCM460细胞中,我们利用不同浓度的LPS(100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL)单独刺激或100ng/mL LPS与不同浓度的TRAIL(100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL、800 ng/mL)共同刺激NCM460细胞,使用caspase3/7活性检测试剂盒和流式细胞术检测细胞受损凋亡情况;收取细胞蛋白,利用蛋白免疫印迹实验Western blot检测DR5、Bax和Bak的表达;流式细胞术检测细胞ROS的释放。用100 ng/mL LPS单独刺激或100 ng/mL LPS与不同浓度的TRAIL(50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL)、sDR5-Fc(100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL)共同刺激THP-1细胞,使用Western blot检测NLRP3、pro-caspase1、caspase1-p20、p-p65、DR5的蛋白表达水平。结果(1)体内实验表明急性溃疡性结肠炎模型组小鼠体重明显下降、DAI评分明显增加、结肠长度明显缩短;此外,结肠组织结构破坏,炎细胞浸润增多,肠隐窝数量明显减少,而sDR5-Fc治疗组小鼠以上症状明显改善。同时,sDR5-Fc可以减少结肠组织巨噬细胞的浸润,上调肠系膜淋巴结中M2型巨噬细胞,下调M1型巨噬细胞。免疫组化对NLRP3和巨噬细胞定位的结果表明组织中浸润的巨噬细胞是表达NLRP3的主要细胞,而sDR5-Fc组小鼠结肠组织的NLRP3、Caspase1、IL-1β的基因和蛋白水平与IgG组相比明显下降。除此之外,RT-PCR的结果显示sDR5-Fc治疗组小鼠的MCP-1趋化因子和TNFα炎症因子的基因水平明显比IgG组降低。(2)体外结果显示SDR5-Fc可以抑制TRAIL诱导的THP-1细胞NLRP3炎症小体的活化;另外,sDR5-Fc能够抑制TRAIL诱导的NCM460细胞凋亡。(3)HE验证sDR5-Fc的安全性显示小鼠的心肝脾肺肾的组织学结构与正常组无差异。结论sDR5-Fc通过与TRAIL结合抑制了结肠上皮细胞的损伤和巨噬细胞NLRP3炎症小体的活化及炎性因子的分泌,从而改善了小鼠急性溃疡性结肠炎的疾病进展。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R574.62
【图文】：

疾病症状

结果结果1. sDR5-Fc 能够改善 UC 的疾病进展我们用 DSS 诱导小鼠急性溃疡性结肠炎，溃疡性结肠炎在建模过程中评价标准主要有体重下降程度和疾病活动性指数[26]，所以我们在建模期间每天记录小鼠体重和进行DAI 评分。结果显示建立模型后 DSS 组和 hIgG 组小鼠与 Normal 组相比体重下降，DAI 评分显著升高，而 sDR5-Fc 组治疗后体重明显增加（图 1-1A），DAI 评分明显下降（图 1-1B），这说明 sDR5-Fc 可以减轻 UC 疾病症状。

巨噬细胞,肠系膜淋巴结,小鼠,分型

图 1-2 sDR5-Fc 改善 UC 疾病的病理损伤。A 图为小鼠处死以后取各组结肠拍照结果；B 图为结肠长度统计结果；C 图为组织结构病理改变；D 为组织损伤病理评分。2. sDR5-Fc 能够减轻 UC 炎症的发展2.1 sDR5-Fc 能够减少 UC 小鼠巨噬细胞的浸润在溃疡性结肠炎的发生发展中，巨噬细胞扮演了很重要的角色。巨噬细胞在炎症状态下会分泌促炎因子导致组织损伤[5,27]，所以我们检测了结肠组织中巨噬细胞的浸润和小鼠肠系膜淋巴结的巨噬细胞分型。结果显示 DSS 模型组和 hIgG 组小鼠结肠组织里巨噬细胞明显增多（图 2-1A），肠系膜淋巴结中 M1 型巨噬细胞明显增加，M2 型巨噬细胞下降（图 2-1B、2-1C）；而 sDR5-Fc 组的小鼠与 DSS 和 hIgG 组相比，结肠组织浸润的巨噬细胞明显下降，肠系膜淋巴结中 M2 型巨噬细胞明显增高。这表明 sDR5-Fc 可以降低 UC 小鼠结肠组织巨噬细胞的浸润，且能影响肠系膜淋巴结中巨噬细胞的分型。10×

巨噬细胞,炎症

图 2-1 sDR5-Fc 能够减少 UC 巨噬细胞的浸润。A 图为各组结肠组织里 F4/80 标记的巨噬细胞结果；B 图为各组小鼠肠系膜淋巴结巨噬细胞分型的检测结果；C 图为统计结果。2.2 sDR5-Fc 能够抑制 NLRP3 炎症小体的活化NLRP3 炎症小体在溃疡性结肠炎的发生发展也起到了很重要的作用[11,28]，炎症疾 NLRP3 炎症小体的活化越来越多的受到重视。既然 sDR5-Fc 能够降低巨噬细胞的，那么它是否会影响与巨噬细胞有关的 NLRP3 炎症小体的活化呢？首先我们LRP3 和巨噬细胞（F4/80 标记）进行了连续切片免疫组化共定位，结果表明浸润的

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