细菌脂多糖诱导小鼠急性凋亡性肝损伤的分子机制

发布时间：2020-08-29 09:26

　　细菌脂多糖(LPS)和氨基半乳糖(GalN)共处理诱导以肝脏细胞凋亡为主要特征的急性肝损伤,肿瘤坏死因子α(TNF-α)在GalN/LPS引起小鼠急性凋亡性肝损伤过程中起关键作用。体外研究发现,核因子κB(NF-κB)激活对抗TNF-α介导的肝细胞凋亡,而外源性活性氧(ROS)或内源性氧化应激均可加重TNF-α介导的肝细胞凋亡。本课题通过深入研究NF-κB抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)及抗氧化剂褪黑素(MT)和N-乙酰半胱氨酸(NAC)分别对GalN/LPS诱导小鼠急性凋亡性肝损伤的不同效应,继而阐明NF-κB激活和ROS生成在GalN/LPS诱导小鼠急性凋亡性肝损伤中的不同作用。 1.PDTC对GalN/LPS诱导小鼠急性凋亡性肝损伤的效应目的通过研究PDTC对GalN/LPS诱导小鼠急性凋亡性肝损伤的效应,以阐明NF-κB在LPS诱导小鼠急性凋亡性肝损伤中的作用。方法本研究设置生理盐水(NS)组、LPS组、GalN组、GalN/LPS组、PDTC+GalN/LPS组和PDTC组。GalN/LPS组同时给予小鼠LPS(20μg/kg,i.p.)和GalN(600 mg/kg,i.p.),PDTC+GalN/LPS组小鼠于LPS(20μg/kg,i.p.)处理前24 h和2 h分别经腹腔注射PDTC(100+100 mg/kg),LPS组、GalN组和PDTC组分别给予小鼠LPS(20μg/kg,i.p.)、GalN(600 mg/kg,i.p.)和PDTC(100+100 mg/kg),NS组小鼠给予等容积生理盐水。每组10只小鼠被用于观察LPS处理后72 h内的动物死亡情况;每组6只小鼠经LPS处理后1.5 h被取血、处死并留取肝脏,用RT-PCR检测肝脏组织TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达水平,用EMSA分析肝脏NF-κB结合活性,用ELISA测定血清TNF-α含量;每组12只小鼠于LPS处理后8 h取血、处死并留取肝脏,测定血清丙氨酸转氨酶(ALT)活力、一氧化氮(NO)水平和肝组织还原性谷胱甘肽(GSH)含量,用比色法检测肝脏caspase-3活性,用TUNEL技术和DNA断裂分析方法检测肝脏细胞凋亡,并对肝组织切片行常规HE染色。结果GalN/LPS共处理显著升高小鼠血清ALT活力;肝脏组织病理学检查发现,GalN/LPS组小鼠肝脏严重充血、坏死并伴有大量炎性细胞浸润,肝脏组织TUNEL阳性细胞显著增多;GalN/LPS处理的小鼠肝脏组织caspase-3活性明显升高;在GalN/LPS共处理72 h内有90%小鼠发生死亡,所有死亡小鼠均伴有肝脏严重充血。PDTC预处理抑制GalN/LPS诱导的肝脏NF-κB激活和TNF-α表达,但PDTC预处理反而加重GalN/LPS引起的小鼠肝脏细胞凋亡、进一步升高血清ALT活力、加重肝脏充血和坏死并加速小鼠死亡。结论NF-κB抑制剂PDTC通过抑制肝脏实质细胞NF-κB介导的抗凋亡机制加重GalN/LPS诱导的小鼠急性凋亡性肝损伤。 2.MT对GalN/LPS诱导小鼠急性凋亡性肝损伤的效应目的通过探讨MT对GalN/LPS诱导小鼠急性凋亡性肝损伤的效应,以阐明ROS在LPS诱导小鼠急性凋亡性肝损伤中的作用。方法实验小鼠被随机分为3组。GalN/LPS组小鼠被同时给予GalN(600 mg/kg,i.p.)和LPS(20μg/kg,i.p.);MT+GalN/LPS于GalN/LPS处理前0.5 h给予MT(5.0 mg/kg,i.p.),且在GalN/LPS处理后1 h、2 h再分别腹腔给予MT(2.5 mg/kg)处理;NS组小鼠经腹腔注射等容积生理盐水。经GalN/LPS处理8 h后,摘眼球取血、处死并取肝脏,检测血清ALT活力、TNF-α和NO水平,测定肝脏组织caspase-3活性、还原性GSH含量、GSH-Px活性和GSH-Rd活性,采用DNA梯度分析方法检测肝脏细胞凋亡,并对小鼠部分肝脏行病理组织学检查。结果GalN/LPS处理显著升高小鼠血清ALT活力,引起小鼠肝脏组织严重充血、坏死并伴有大量炎性细胞浸润,而且GalN/LPS明显升高小鼠肝脏组织caspase-3活性和增多肝脏凋亡细胞数。进一步研究结果显示,MT处理明显降低GalN/LPS升高的小鼠血清ALT活力。同时,MT处理也明显减轻肝脏充血和坏死。另一项实验结果表明,MT明显减轻GalN/LPS引起小鼠肝脏细胞凋亡,表现为肝脏caspase-3活性下降和DNA断裂的减少。而且,MT处理明显减轻GalN/LPS引起的肝脏组织GSH损耗,显著升高肝脏组织GSH-Rd和GSH-Px活性。结论抗氧化剂MT减弱GalN/LPS引起的小鼠急性凋亡性肝损伤。 3.NAC对GalN/LPS诱导小鼠急性凋亡性肝损伤的效应目的通过探讨N-乙酰半胱氨酸(NAC)对GalN/LPS诱导小鼠急性凋亡性肝损伤的效应,以阐明ROS在LPS诱导小鼠急性凋亡性肝损伤中的作用。方法雌性ICR小鼠被随机分成4组。除NS组外,所有小鼠均被同时给予GalN(600 mg/kg,i.p.)和LPS(20μg/kg,i.p.);NAC/GalN/LPS组小鼠于GalN/LPS共处理前30 min给予NAC(150 mg/kg,i.p.);BSO/NAC/GalN/LPS组小鼠于GalN/LPS共处理前12 h和2 h被分别注射BSO(100 mg/kg,i.p.),并于GalN/LPS共处理前30 min给予NAC(150 mg/kg,i.p.);NS组小鼠经腹腔注射给予等容量生理盐水。GalN/LPS处理1.5 h后,部分动物被剖杀、取血,并测定血清TNF-α含量;于GalN/LPS处理8 h后,剩余动物被剖杀、取血和肝脏,测定血清ALT活力和NO水平,检测肝脏组织caspase-3活性与GSH含量,采用DNA断裂分析方法检测肝脏凋亡,并对部分小鼠肝脏行病理组织学检查。结果GalN/LPS处理显著升高小鼠血清ALT活力,引起小鼠肝脏组织严重充血、坏死并伴有大量炎性细胞浸润,而且GalN/LPS明显升高小鼠肝脏组织caspase-3活性和增多肝脏凋亡细胞数。进一步研究结果显示,NAC处理明显降低GalN/LPS升高的小鼠血清ALT活力。同时,NAC处理也明显减轻肝脏充血和坏死。另一项实验结果表明,NAC明显减轻GalN/LPS引起小鼠肝脏细胞凋亡,表现为肝脏caspase-3活性下降和DNA断裂的减少。而且,NAC处理明显减轻GalN/LPS引起的肝脏组织还原型GSH损耗。结论抗氧化剂NAC保护GalN/LPS引起的小鼠急性凋亡性肝损伤。综上所述,本研究可得出如下结论:NF-κB激活在LPS诱导小鼠急性凋亡性肝脏损伤中起保护作用,而ROS生成在LPS诱导小鼠急性凋亡性肝脏损伤中起促进作用。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2009
【中图分类】：R575
【部分图文】：

小鼠,计量资料,联合处理,χ2检验

计学处理肝脏组织 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 mRNA 水平用同一样品 GAP结果用均数±标准差（—x ±s）表示，计量资料用 t 检验和方差计学差异，计数资料用χ2检验统计分析。P＜0.05 为组间差异C 对 GalN/LPS 诱导小鼠急性肝损伤的效应TC 对 GalN/LPS 引起小鼠死亡的影响给予 GalN 或 LPS 未观察到小鼠死亡；GalN+LPS 联合处理PS 处理后 16 h 内死亡，而 PDTC＋GalN/LPS 组 90％小鼠死亡8 h 内出现（图 1）。

细菌脂多糖诱导小鼠急性凋亡性肝损伤的分子机制

PDTC对GalN/LPS引起的肝脏组织病理学改变的影响A-F分别为NS组、GalN组、LPS组、GalN/LPS组、PDTC组和PDTC+GalN/LPS组，HE染放大200倍

肝脏,凋亡

20 3 PDTC 对 GalN/LPS 诱导肝脏凋亡的影响 A：NS (1)、GalN (2)、LPS (3)、GalN/LPS (DTC (5)、PDTC/GalN/LPS (6)；B：与 NS 组比较， P < 0.05, P < 0.01；与 GalN/LPS 组，**P < 0.01；C：NS(a)、GalN(b)、LPS (c)、GalN/LPS (d)、PDTC (e)、PDTC/GalN/LPSig. 3 Effects of PDTC on GalN/LPS-induced hepatic apoptosis. (A) Hepatic DNA fragmentahe results are a representative of four independent experiments. NS (lane 1); GalN (lane 2); Lane 3); GalN/LPS (lane 4); PDTC (lane 5); PDTC+GalN/LPS (lane 6). (B) Hepatic caspasctivity (n = 12). P < 0.05, P < 0.01 as compared with NS group. **P < 0.01 as compared walN/LPS group. (C) TUNEL staining (arrow) of liver sections from mice treated with GalN/LPSDTC plus GalN/LPS. Magnification: 200×. (a) NS; (b) GalN; (c) LPS; (d) GalN/LPS; (e) PDTCDTC+GalN/LPS. Arrows show TUNEL-positive cells.

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