同型半胱氨酸在早年应激诱导的肠易激综合征中的作用及其甲基化机制

发布时间：2020-08-29 11:15

　　肠易激综合征(IBS)是一种功能紊乱性肠病,其症状主要表现为腹部疼痛或不适,伴有排便习惯或性状改变,发病率高,因其反复发作的特点为患病人群带来较大的生活负担,但目前该病发病机制尚不明确,流行病学调查显示,应激可造成IBS症状发作或加重。应激是生物机体在受到内外环境因素及社会、心理因素刺激时所出现的全身性非特异性适应反应,又称应激反应。而生命早期应激,如幼年期的精神创伤等早年负性生活事件,会增加成年后疾病的易感性,目前受到人们越来越多的关注。因此对早期应激损伤诱导的IBS的研究具有重要而独特的作用,其机制可能涉及脑-肠轴的异常变化和神经免疫内分泌网络中活性物质的异常等。近年来发现肠道菌群在脑-肠轴中扮演越来越重要的角色,菌群失调可能导致肠道内环境的紊乱和氨基酸等营养物质的代谢异常,而异常的氨基酸代谢可能导致体内活性代谢产物的异常,从而参与IBS的发病。其中,蛋氨酸在体内代谢循环中产生的一种活性物质,即同型半胱氨酸(Hcy),被公认为多种疾病的危险因子,其可能在IBS的发生发展中起到重要损伤作用,而其代谢途径中产生的甲基基团可能参与IBS相关症状的表观遗传学机制。因此,本研究从"早年应激损伤——肠道菌群失调——氨基酸代谢改变——Hcy损伤作用”这个新的的研究思路出发,揭示IBS的发病机制,并进一步探索Hcy介导的甲基化机制在IBS表观遗传学中的作用。这不仅对揭示IBS的发病机制,也对生物学诊断与治疗提供新的启示和科学依据,也对探索早年应激损伤诱导的其它疾病的生物学防治提供一定的启示和科学思路。第一章早年应激致IBS大鼠肠道菌群和氨基酸代谢的变化目的:检测早年应激致IBS大鼠肠道菌群和氨基酸代谢的改变,探讨肠道菌群失调和氨基酸代谢异常在IBS相关症状中的作用及损伤机制。方法:(1)IBS动物模型建立及行为学评价:选用新生期大鼠母婴分离(MS)的方式建立早年应激诱导的IBS疾病模型。采用行为学实验来评价和确认肠易激综合征动物模型的建立,包括结直肠扩张(CRD)-腹部回撤反射试验检测内脏敏感性、新异环境中排便性状和数量检测肠道转运功能、旷场试验和糖水偏嗜度试验检测精神行为改变,以及结肠组织HE染色。(2)肠道菌群的检测和分析:使用粪便基因组DNA快速提取试剂盒提取大鼠粪便样本中细菌基因组DNA,针对16S r DNA基因可变区域进行引物合成、扩增及测序,利用软件进行粪便样品的多样性分析。(3)氨基酸的检测:使用全自动氨基酸分析仪对各组大鼠粪便和血清样本进行氨基酸浓度检测。结果:(1)经过母婴分离干预后,与正常对照组相比,可见MS大鼠CRD容量阈值下降(P0.05),提示内脏敏感性增强;MS大鼠排便数目增多(P0.05),提示肠道转运功能增强;MS大鼠中央区停留时间减少(P0.05),提示焦虑样行为更加明显;MS大鼠糖水偏嗜度明显降低(P0.05),提示抑郁样行为增加;MS大鼠结肠HE病理染色未发现明显形态学改变,与IBS病理特点一致。以上表明成功建立早年应激致IBS大鼠模型。(2)肠道菌群Alpha多样性分析中,与正常对照组相比,IBS大鼠的Shannon指数下降,提示IBS大鼠的菌群多样性下降。Beta多样性指数中的Lef Se分析中,IBS大鼠肠道菌群中毛螺菌科、单形拟杆菌、克里斯滕森菌科、δ变形菌纲、脱硫弧菌目、脱硫弧菌科和脱硫弧菌属的相对丰度均比正常对照组显著升高。(3)氨基酸分析发现,与正常对照组相比,IBS大鼠粪便中丝氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、脯氨酸和赖氨酸均明显升高;血清中蛋氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸显著升高,而甘氨酸和赖氨酸则明显下降。结论:(1)母婴分离方式建立早年应激诱导的IBS大鼠疾病模型。(2)IBS大鼠肠道菌群多样性降低,部分氨基酸代谢发生变化,它们可能共同参与了IBS的发病过程。其中蛋氨酸的显著变化提示含硫氨基酸可能在IBS的发病机制中起到重要作用。第二章Hcy在早年应激所致IBS中的作用及对甲基化水平的影响目的:研究Hcy在早年应激所致IBS中的损伤作用,并检测Hcy对甲基化水平的影响。方法:(1)Hcy在早年应激致IBS中的损伤作用:建立早年应激致IBS大鼠模型,实验动物分组为C组、MS组、MS+Met组和MS+Vit组。使用高效液相色谱法检测血浆Hcy水平。(2)Hcy对早年应激致IBS大鼠机体甲基化水平的影响:实验动物分组为C组、MS组和MS+Vit组。使用ELISA法检测大鼠血浆S-腺苷甲硫氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸和结肠组织DNA总甲基化程度,使用Western blot法检测DNMT1、DNMT 3a/3b的蛋白表达,使用实时荧光定量PCR法检测DNMT1、DNMT3a/3b m RNA水平,使用ELISA法检测DNMTs的总活性。结果:(1)血浆Hcy浓度检测发现,MS组比C组血浆Hcy浓度明显升高(P0.05);MS+Met组和MS+Vit组分别在MS组的基础上升高和降低了Hcy水平(P0.05),说明二者对Hcy水平具有相反方向的调控作用。行为学实验结果显示,MS+Met组比MS组的肠道症状和精神症状更加明显,而MS+Vit组在MS组的基础上缓解了上述症状(P0.05)。提示Hcy水平越高,IBS大鼠的的症状越明显,Hcy可能是IBS的损伤因子。(2)与C组相比,MS组大鼠的血浆SAM水平显著升高,SAH水平显著降低,代表甲基化潜能的SAM/SAH比值则显著升高;MS组大鼠结肠组织DNA总甲基化水平、结肠组织DNMT 3b的表达水平和DNMTs总活性明显升高,DNMT1和DNMT 3a未见显著性差异。经Vit B干预后,可缓解上述改变。结论:(1)Hcy可能是IBS的损伤因子,Hcy水平越高,IBS的症状越重。(2)Hcy水平变化引起了体内甲基化相关指标的变化,说明Hcy水平调控了体内的甲基化机制。第三章Hcy介导的甲基化机制调控IBS的分子基础目的:探索Hcy介导的甲基化机制在IBS肠道屏障功能损伤中的分子基础。方法:(1)Hcy对Claudin-1和Claudin-2表达的损伤效应:针对C组、MS组和MS+Vit组,使用实时荧光定量PCR和Western blot法分别对Claudin-1和Claudin-2以及Me CP2的m RNA水平和蛋白表达水平进行检测,使用甲基化特异性PCR(MSP)技术分别检测claudin-1和claudin-2基因启动子甲基化水平。(2)Hcy介导的甲基化机制对Claudin-1和Claudin-2表达的影响:使用甲基转移酶抑制剂地西他滨(Decitabine,Dac)降低MS组大鼠的甲基转移酶总活性,针对C组、MS组和MS+Dac组,使用ELISA法检测结肠组织DNA总甲基化程度,分别使用MSP技术、实时荧光定量PCR技术和Western blot法检测claudin-1和claudin-2基因启动子甲基化水平及其表达水平,并检测Me CP2表达水平。结果:(1)与C组相比,MS组的claudin-1 m RNA水平和蛋白表达水平下降,基因启动子甲基化水平升高;MS+Vit组则逆转了此趋势。与C组相比,MS组的claudin-2 m RNA水平和蛋白表达水平升高,基因启动子甲基化水平降低;MS+Vit组则逆转了此趋势。Hcy水平越高,Me CP2表达越高。(2)与MS组相比,MS+Dac组总体DNA甲基化水平和甲基转移酶总活性有所下降,claudin-1和claudin-2基因启动子甲基化程度均有明显下降,其相应的m RNA水平和蛋白表达水平均有明显升高。DNA甲基化程度越高,Me CP2表达越高。说明甲基化机制在claudin-1和claudin-2基因启动子甲基化程度及表达水平中起到调控作用。结论:(1)Claudin-1和Claudin-2是Hcy损伤效应的分子基础,而Hcy介导的甲基化机制可能参与其调控。(2)Hcy介导的甲基化机制参与了对Claudin-1和Claudin-2表达调控。
【学位单位】：军事科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R574.4
【部分图文】：

反射模式,腹部

将 8Fr 儿童导尿管的头端用石蜡油充分润滑，轻轻向肛肠 5-8cm，并将导尿管尾端用医用胶带固定在鼠尾根窄的固定笼内，使其无法转身。待大鼠清醒并适应笼温生理盐水经导尿管外口注入位于大鼠结直肠内的球加量，每次加量 0.4ml，直至最高 2.0ml，此过程中球观察每次加量时大鼠腹部的反应及是否抬离接触面，道缺血，每次持续 20 s 即可，重复测量 3 次，两次之评分标准（图 1-1)：肠扩张时无明显行为学反应；肠扩张时头部动作减少，身体无动作；肠扩张时腹肌略有收缩，但腹部未抬离接触面；肠扩张时腹肌收缩强烈并抬离接触面；肠扩张时腹部及骨盆抬起，身体呈现弓形。能够引起 3 分腹部反应的最小注射容量阈值来评价内确、易于判断、利于比较、结果稳定、可靠性强等优

建库流程

图 1-2 建库流程图，先对样本浓度初步检测，并将样本稀释至浓度 insert size，符合标准后使用荧光定量 PCR 仪和本 qPCR 试验，再对文库中的样本的有效浓度库采用 Miseq 测序，实施方案为 Illumina PE250析流程步的结果后，通过去除接头污染、低质量碱基，再将分别从两端测序所获得的 Read1 与 Read。采用软件 QIIME 1.8.0 版本分析拼接后的序、Alpha 多样性分析和 Beta 多样性分析等。序部分由北京安诺优达基因科技有限公司完成。

量表,大鼠,分离模型,临床特征

图 1-4. Bristol 粪便性状量表可用来评价结肠转运功能，其多少反映了结肠远显示，在新异环境应激（旷场试验箱）的过程中组大鼠粪便排出量明显增多（3.12±0.39 vs. 1.87母婴分离应激使大鼠在受到应激环境刺激（新异常，故此母婴分离模型能够模拟 IBS 的临床特征C MS01234*fecaloutput(pelets)

【参考文献】