Roquin-1调节巨噬细胞免疫应答参与肝脏缺血再灌注损伤的研究

发布时间：2020-08-31 09:13

　　 随着肝脏外科手术的广泛开展,手术中因阻断肝脏血供而导致的缺血再灌注(ischemia reperfuion,IR)损伤越来越得到重视。最先由Jennings于20世纪60年代报道。主要指缺血缺氧的组织器官在重新获得血供氧供后,其功能不但没有恢复,反而其结构功能和组织代谢破坏加剧的现象。免疫失衡是致使肝脏损伤的最重要缘由,固有免疫和适应性免疫在IR过程中起到关键的作用。如何调控免疫平衡是目前肝脏IR损伤治疗的热点和难点。Roquin-1已证实在固有免疫及免疫平衡中起到重要的作用。其含有的RING指结构域具有E3泛素连接酶的活性。在T细胞中,它可以连接AMPK并调控其泛素化,进而影响T细胞亚群的分化和功能。同时,其C3H1锌指结构域和ROQ结构域和mRNA的3’-UTR结合,并影响mRNA的半衰期。在IR损伤领域,在通过抑制MCP-1建立的心脏IR模型中发现Roquin-1的mRNA表达升高;在心脏缺血性疾病标本中发现Roquin-1的表达明显增高。Roquin-1在缺血早期可抑制细胞凋亡从而缓解缺血进展;在缺血晚期可抑制炎症反应并缓解器官重构及失功。在肝脏IR过程中,Roquin-1的作用及机制尚未清楚。研究Roquin-1在肝脏IR中的作用对临床诊疗工作具有重要意义。巨噬细胞(macrophage,m?)是肝脏IR中重要的天然免疫细胞。在肝脏IR早期便接受HMBG1等上游信号,向M1和/或M2极化,并分泌白细胞介素、肿瘤坏死因子、转化生长因子等细胞因子,进一步影响适应性免疫。同时,研究显示Roquin-1缺乏可导致全身炎症症状,肝脏内m?浸润增多;因TNF过表达,对LPS导致的感染性休克更加敏感。那么,研究Roquin-1对m?的影响及机制则十分重要。基于以上内容,本课题研究了Roquin-1调节m?免疫应答并影响肝脏IR损伤的机制。1.Roquin-1对肝脏IR的影响为了探讨Roquin-1对肝脏IR的影响,我们建立小鼠肝脏IR模型。通过PCR、WB和免疫组化(IHC)技术发现,Roquin-1在IR后1小时表达增多,以后表达减少。同时,免疫荧光双标提示Roquin-1主要在m?表达。进一步,我们使用去除m?,并在肝脏IR 1小时前尾静脉输注干扰Roquin-1表达的m?,发现m?的Roquin-1干扰后肝脏IR损伤加重。另外,PCR及ELISA结果提示干扰Rqouin-1后,m?向M1极化增多、向M2极化减少。2.Roquin-1通过AMPK/m TOR/STAT3信号通路调节m?极化和功能体外研究部分,我们分离骨髓来源巨噬细胞(Bone marrow devired macrophage,BMDM)并诱导其向M1、M2的极化。结果显示干扰Roquin-1可促进m?向M1极化,抑制M2的极化。进一步利用WB技术及AMPK和mTOR抑制剂,结果显示Roquin-1通过抑制AMPKα磷酸化,促进mTOR和STAT3的磷酸化。3.Roquin-1调控AMPKα泛素化及其活性为了研究AMPKα和泛素化的关系,我们在体外利用AICAR激活AMPKα,发现激活AMPKα后其自身泛素化水平下降。我们进一步通过生物信息学对AMPK的潜在的泛素化位点进行预测。通过体外点突变实验,我们证实了这些位点的泛素化受到Roquin-1的调节。同时,通过WB检测AMPKα的下游底物ACC1和Raptor的磷酸化,我们发现Roquin-1的干扰抑制了促进了AMPKα的激活及其功能。总之,我们的研究结果表明,Roquin-1在肝脏IR的重要作用。首先,Roquin-1主要在m?表达,并抑制m?向M1极化,促进其向M2极化。进一步,Roquin-1在m?中通过促进泛素化抑制了AMPKα的活性,从而进一步促进了mTOR和STAT3的活性。本课题阐述了Roquin-1对肝脏IR损伤的保护,并探讨了其主要机制为通过泛素化调节AMPKα的活性并影响m?的极化和功能。为临床对肝脏IR损伤的干预提供了一定的理论基础。
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R575
【部分图文】：

图 1.1 小鼠肝脏 HE、IHC、RT-qPCR、WB，血清 ALT、AST。小鼠肝脏 IR后，HE 及血清 ALT、AST 结果提示建模成功（A-B）;RT-qPCR、WB 和 IHC 结果提示 Roquin-1 在肝脏 IR 后 1h 表达增高，6、12h 表达降低，24h 有所恢复（。n=6）同时，为了明确 Roquin-1 在肝脏哪种细胞中显著表达，我们使用了免疫荧光双标技术（图 1.2）。结果显示 Roquin-1 主要在肝脏的巨噬细胞中表达。

图 1.1 小鼠肝脏 HE、IHC、RT-qPCR、WB，血清 ALT、AST。小鼠肝脏 IR后，HE 及血清 ALT、AST 结果提示建模成功（A-B）;RT-qPCR、WB 和 IHC 结果提示 Roquin-1 在肝脏 IR 后 1h 表达增高，6、12h 表达降低，24h 有所恢复（。n=6）同时，为了明确 Roquin-1 在肝脏哪种细胞中显著表达，我们使用了免疫荧光双标技术（图 1.2）。结果显示 Roquin-1 主要在肝脏的巨噬细胞中表达。

南京医科大学博士学位论文进一步为了证实巨噬细胞在肝脏 IR 中的作用，我们利用 Liposomes 清除小鼠体内的巨噬细胞，在肝脏 IR 前 1h 经尾静脉注干扰了 Roquin-1 表达的巨噬细胞。HE、 Suzuki’s 评分及血清 ALT、AST 结果显示，注射干扰 Roquin-1 表达巨噬细胞的小鼠 IR 损伤较 WT 显著加重（图 1.3）。

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本文编号：2808594