人源性肝细胞系的构建

发布时间：2020-09-09 13:55

　　 研究背景 随着肝细胞分离、高密度培养以及生物反应器等技术的日臻成熟，新一代以培养肝细胞为基础的现代生物人工肝(bioartificial liver，BAL)——体外人工肝支持系统(extracorporeal bioartificial liver support system，EBLSS)被认为是治疗因各种原因所致暴发性肝衰竭或急性肝衰竭(fulminant hepatic failure，FHF，acute hepatic failure，AHF)最有前途的，并已在动物实验及临床应用中取得了确切疗效。肝细胞作为BAL的主要生物成分，在该系统中扮演着举足轻重的角色。正常人肝组织和培养人肝细胞是理想的BAL细胞源和体外药物代谢模型，但由于全世界范围内的供肝短缺以及原代培养时存活时间短和难以传代等缺点，使得利用正常人肝脏分离肝细胞来作为BAL的细胞源显得非常困难。胎肝细胞尤其是从较大月龄胎肝分离到的肝细胞，虽能在体外继续分化增殖，且免疫原性弱，较少引起异种蛋白反应，但同样受制于来源问题和伦理学原因，使得难以在临床推广应用。 为此有学者试度采用永生化肝细胞来克服这些不足，如C3A、HepG2、CL—1等细胞系。在美国采用C3A和HepG2细胞构建EBLSS治疗FHF动物和少量临床试验已获肯定结果，其中以C3A细胞构建的EBLSS已被批准进行二期临床试验。但上述细胞系均来源于肿瘤细胞，研究显示无论在P450活性、氨清除功能以及尿素合成等方面均不如猪肝细胞，加之以肿瘤源性肝细胞作为治疗工具，用于处于免疫抑制状态下的FHF患者，尤其是将接受肝脏移植、需终生使用免疫抑制剂的患者身上，总觉令人担忧。本实验采用脂质体转染法，将猿猴病毒40大T抗原(SV40LTag)基因转染至来源于正常成人原位肝移植的供肝细胞，建立一永生化肝细胞系。 m03浙江人学博士论文 第一部分摘婴 新型人源性肝细胞系的构廷 材料和方法 SV40 DNA（strain 776）、月 质体转染试剂盒、IV型胶原酶、 hepatoZYME－SFM培养基、DMEM培养基、G418等购自美国Invitrogen 公司； 真核表达载体 pCDNA3．1（－）为本研究所保存载体；胎牛血清＊BS）购自美国 Hyclone公司；PCR产物纯化试剂盒。凝胶电泳切胶回收试剂盒、质粒抽提试 剂盒等购自美国 QIAGEN公司；限制性内切酶 BamH、限制性内切酶 BstX l、T4连接酶、DNA Marker等购自美国 Promega公司；DHS u大肠杆菌山本 实验室提供。实验所需主要试仪器设备有：PCR扩增仪、蛋白核酸测定仪、纯 水仪、低温高速离心机、水平电泳仪、低温冰箱，凝胶电泳成相系统、自行设计 的体外灌流装置。成人肝细胞来自一位O型血、年龄25岁的健康男性原位肝移 植供肝。 首选采用 PCR方法，以 SV40全序列 DNA为模板，扩增 SV40LTag DNA； T4 DNA连接酶连接经 BamH酶切 SV40LT8g DNA牙 pcDNA3．1（十 构建 SV40LTag—pCDNA3．1卜）重组载体并转化至 DHS Q大肠杆菌感受态细胞，通过 BStX酶切鉴定和 DNA序列测定以确定重组载体；最后利用脂质体转染法将 SVp0LTag—pCDNA3．1（－）重组载体转染至正常成人肝细胞，经G418筛选，直 至获得阳性克隆细胞并观察转染细胞的形态特征。 结果 经DNA序列测定和比只结合GenBank网站公布的SV40LTag DNA序列， SV40LT8g基因共 2607hp正确插入真核表达载体 pCDNA3．1（－卜利用脂质体转 染法将 SV40LTag—pcDNA3．1（－）重组载体转染至正常成人肝细胞，经 700S G418筛选 42天，出现一明显的上皮细胞样抗 G418的阳性克隆 细胞，空载体组和空白对照组细胞大多死亡。形态学观察表明，转染肝细胞呈上 皮细胞样、单层贴壁生长，在含 15％FBS的低糖 DMEM培养基中，传代一次只 需3＊天时间：相比在怕p扒。＊＊MB8「M无血清培养基中细胞增殖时间明显延 2 2皿3iM江大学博士论文 柬一部分摘婴 新型人源性肝细胞床的构延 长，传代一次需5天时间：但转染肝细胞在两种培养基中不予传代存活时间相 差无几，约12天左右，之后便出现迅速死亡。 结论 1 在国内首次利用正常成人肝移植供肝进行肝细胞分离和原代培养。 2在国内首次利用 SV40LTag 基因和真核表达载体 pCDNA3．1个卜 构建 SV40LTSP—PCDNA3．1（－）重组载体，经脂质体转染至成人肝细胞建立一永生化 肝细胞。 3新建人源性肝细胞系在体外可无限传代。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2003
【中图分类】：R575.3
【部分图文】：

SV40限制性内切酶位点图

甘加.心毖.。翻侧毖侧门.洲目.，日翻扭口11，..’，侧，I二万困月.侧.1侧日加.冲“日.如砚h.胭面.已妙.甲...吻自.图1SV40限制性内切酶位点图

图3真核表达载体PeDNA3.1‘)人肝细胞人原位肝移植的供肝细胞来自一位O型血、年龄25岁的合法健方法用实验试剂的配制常用平衡盐溶液等的配方(g/L)(参考Pollardetal.1997，鄂征1HankSD一HankSW胶原酶胰蛋EOTA液O3IZ·6HZO4·7HZO液液液液.n乙n04no_400.400，404040400.060.060.060.060.060.10一0.10一0.100.10

【共引文献】

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本文编号：2815059