间充质干细胞通过诱导2型kupffercell激活对CCL4诱导的小鼠肝硬化影响的实验研究

发布时间：2020-09-10 20:17

　　目的：1.分离、鉴定小鼠骨髓间充质干细胞；2.建立肝硬化小鼠模型以及去除肝硬化小鼠体内枯否细胞的小鼠动物模型；3.将分离成功的骨髓间充质干细胞移植给实验小鼠三周后，观察四组小鼠疗效以及肝枯否细胞在体内表型及功能的改变；4.探讨枯否细胞是否参与了间充质干细胞改善肝硬化的过程。方法：1.采用全骨髓贴壁法联合体外培养获得高纯度的雄性C57BL/6小鼠的骨髓间充质干细胞。2.通过骨髓间充质干细胞贴壁的特性以及形态学特征，再结合流式细胞术检测表面抗原对其进行鉴定。3.采用10%的CCL4溶于橄榄油，腹腔注射给C57BL/6小鼠，每周三次，共10周诱导肝硬化动物模型，并通过其造模期间肝脏的临床病理表现对其进行鉴定。4.通过磷酸二钠脂质体剔除肝硬化小鼠体内的枯否细胞，并通过免疫组化观察剔除的效率。5.骨髓间充质干细胞移植3周后，收集四组小鼠血清，检测ALB,ALT,AST，观察肝功的改变。通过肝脏组织HE染色、天狼星红染色观察各组小鼠肝脏炎症以及肝纤维化的改变。通过免疫荧光染色，在共聚焦显微镜下观察体内枯否细胞在体内改变。在通过RT-PCR检测肝脏组织IL-10，TNF-α,CD-206，Arg-1,iNos,等mRNA的表达。结果：1.采用全骨髓贴壁法成功获得了骨髓间充质干细胞，呈典型的长梭型，成纤维样，放射状或旋涡状排列。流式细胞仪检测证实，CD-29，CD105表达阳性率在85%以上，CD-34，CD-45表达在15%以下。2.CCL4诱导10周后肝脏组织HE染色，天狼猩红染色证实，肝硬化模型建立成功。3.磷酸脂质体尾静脉注射后24小时免疫组化证实，剔除枯否细胞的效率达90%以上。4.间充质细胞移植3周后，M组的治疗效果明显好于其他三组，肝纤维化程度，肝脏炎症，及肝细胞坏死程度都明显减轻，肝脏功能也得到明显改善。剔除肝脏枯否细胞的L组和LM组治疗效果和对照组C组没有明显的差异，甚至肝硬化及肝细胞坏死程度加剧。5.M组小鼠肝脏内CD68（+）枯否细胞的数量明显低于对照组，而CD206（+）枯否细胞的数量明显高于对照组。6.TR-PCR结果显示，M组与对照组C组相比较促炎因子TNF-α明显降低，抗炎因子IL-10表达升高，M1型枯否细相关的的iNOS mRNA表达降低，M2型枯否细胞相关Arg-1,CD-206的mRNA的表达明显升高。结论：1.成功建立了肝硬化小鼠模型，并证实间充质干细胞可改善CCL4诱导的肝硬化小鼠肝功及纤维化程度。2.肝脏枯否细胞参与了间充质干细胞治疗肝硬化的过程。3.间充质干细胞可能通过诱导M2型肝脏枯否细胞的激活参与了治疗肝硬化的过程。
【学位单位】：延安大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2013
【中图分类】：R575.2
【部分图文】：

小鼠,四氯化碳,肝硬化,免疫组化

G. CCL48W HE 染色（100X） H. CCL48W 天狼星红染色（100X）图 3-1：肝硬化动物模型建立过程中小鼠的肝脏组织病理学改变（HE 及天狼星红）3.2 肝硬化的小鼠去除肝脏内的 KC取四氯化碳造模成功的小鼠剔除 KCs24h 后,免疫组化证实生理盐水水对照组21

组织病理变化,HE染色

L 组 3w LM 组 3w 图 3-3 四组小鼠肝脏组织病理变化 HE 染色（100x） C 组 3w M 组 3w

组织病理变化

L 组 3w LM 组 3w 图 3-3 四组小鼠肝脏组织病理变化 HE 染色（100x）

【参考文献】