Notch信号通路在肝脏缺血再灌注损伤中的作用及作用机制的研究

发布时间：2020-09-11 09:06

　　【背景】缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury IRI)是指组织器官缺血后再灌注不仅不能改善组织器官功能恢复,反而加重组织器官的功能障碍和结构损伤。在心肌缺血、脑卒中、创伤等疾病病理过程中都可发生IRI。肝脏IRI是肝脏外科最常见的病理过程,多见于休克、需要阻断肝脏血流的肝外科手术以及肝移植术等病理生理过程中,研究证实有10%的早期肝移植失败都是由于IRI造成,也是引起肝移植术后急慢性排斥反应的重要因素。目前关于肝脏IRI机制的研究将该病理过程分为两个阶段,早期,多为再灌注后6 h以内,以氧化应激产生大量活性氧族(Reactive oxygen species ROS)直接损伤肝细胞引起肝细胞凋亡坏死为主要特征;后期,以炎细胞浸润释放大量炎症相关因子,进一步放大炎症反应,直接或间接引起肝脏细胞凋亡坏死为特征。经典Notch信号途径在进化上高度保守,研究证实Notch信号途径广泛参与细胞增殖、细胞凋亡及细胞命运决定。在哺乳动物,经典Notch信号通路由5种配体(Jagged1, 2, and Delta-like [Dll] 1, 3,and 4)和4种受体(Notch1-4)组成,当配体与受体结合,Notch信号被激活,在??分泌酶(GSI)的酶切作用下,受体胞内段?(Notch intracellular domain NICD)被剪切,入核,与核内转录因子?RBP-J (recombination signal binding protein J?)?结合,启动下游基因如包括Hes家族在内的碱性螺旋环螺旋因子的表达,进而引发后续分子事件。近年有报道证实,Notch信号参与了细胞对于外界刺激的应答,在心、脑缺血性损伤中都有Notch信号途径的参与。Notch信号是否参与肝脏IRI过程?Notch信号在肝脏IRI中的作用如何?Notch信号在肝脏IRI中发挥作用的分子机制是什么?这些问题的阐明将为IRI相关的研究开辟新的领域,进一步完善肝脏IRI分子调控理论体系,为肝脏IRI的预防和治疗提供理论基础。【目的】研究Notch信号通路在肝脏IRI中的作用,作用的细胞生物学基础及分子机制,探索肝脏IRI新的分子调控机制,为肝脏IRI的预防和治疗提供新的理论依据。【方法】 1.以无创动脉夹夹闭小鼠肝脏左叶、中叶血供90 min,制造小鼠肝脏IRI模型,利用Real-time PCR检测Notch信号通路相关分子在肝脏IRI中的表达变化,利用Western blot检测Notch1受体胞内段的表达水平。 2.利用PCR方法鉴定小鼠基因型,获得Mx-Cre-RBP-Jf/f纯合子小鼠及Mx-Cre-RBP-Jf/+杂合子对照小鼠,PolyI-PolyC诱导,在纯合子小鼠中剔除RBP-J基因,实现阻断Notch信号。通过检测血清ALT、AST水平,组织学HE染色,TUNEL凋亡染色,MPO免疫组织化学,流式细胞仪检测相关炎性细胞浸润情况,Real-time PCR检测炎症因子表达水平,观察阻断Notch信号对肝脏IRI的影响。 3.通过分别将RBP-J剔除和对照小鼠全骨髓细胞移植给致死剂量照射的野生型小鼠,获得在骨髓细胞特异剔除RBP-J小鼠及对照小鼠,行肝脏IRI造模,通过血清ALT、AST检测、组织学HE染色、TUNEL凋亡染色,观察骨髓细胞阻断Notch信号对肝脏IRI的影响。 4.体外应用GSI阻断Notch信号,利用肝细胞体外缺氧(0.5%)培养15 h,正常培养基常氧培养6 h,模拟IRI,通过TUNEL凋亡染色,Casepase3 mRNA水平检,损伤后剩余活细胞计数,条件培养基刺激巨噬细胞后Elisa检测TNFα水平,观察肝细胞阻断Notch信号对IRI的影响。 5.利用DCFH-DA探针结合流式细胞技术检测细胞内ROS水平,利用Real-time PCR检测iNOS、抗凋亡蛋白Bcl-xl mRNA表达水平,Western blot检测iNOS蛋白表达水平,观察阻断Notch信号对肝脏IRI肝细胞内ROS水平的影响,并利用ROS清除剂观察ROS在Notch信号调控肝脏IRI中的作用。 6.利用Real-time PCR检测MnSOD mRNA表达水平,Western blot检测MnSOD、磷酸化STAT3、磷酸化Akt蛋白表达水平,利用免疫共沉淀检测Hes5与STAT3蛋白相互作用,通过过表达持续激活STAT3观察STAT3在Notch调控肝脏IRI中的作用,从而揭示Notch信号通路调控肝脏IRI中肝细胞ROS的分子机制。 7.通过将肝细胞与过表达Notch配体Dll1 OP-9细胞共培养或过表达Hes5激活Notch信号,观察激活Notch信号对肝细胞IRI的影响。【结果】 1.在肝脏IRI中伴随着Notch信号途径的广泛激活及下游分子的表达上调:在肝脏IRI中,Notch1、Notch2、Dll4、Jagged2、Hes5 mRNA表达上调、NICD蛋白表达明显上调。 2.阻断Notch信号会导致肝脏IRI加重。表现为:血清ALT、AST水平升高;肝细胞凋亡、坏死增加;中性粒细胞、T细胞、巨噬细胞浸润增加,炎症因子TNFα、IL1β、IL6、IFNγ,趋化因子CCL3,粘附分子ICAM1产生增加。 3.阻断Notch信号引起肝脏IRI中肝细胞细胞内ROS产生增加,并且,应用ROS清除剂可以挽救Notch信号阻断引起的血清ALT、AST升高,肝细胞凋亡坏死增加,说明Notch信号阻断引起肝细胞内ROS水平升高,最终导致IRI加重。 4.进一步分子机制的研究证实:阻断Notch信号导致下游分子Hes5表达下调使得Hes5-STAT3复合物形成障碍,导致STAT3磷酸化水平下降,引起MnSOD表达下调,最终导致细胞内ROS水平升高,过表达持续激活STAT3可以上调MnSOD表达,降低细胞内ROS水平,挽救IRI中Notch信号阻断引起的细胞凋亡增加。 5.体外配体激活Notch或过表达Hes5对肝细胞IRI起到保护性作用,表现为细胞内ROS水平下降,细胞凋亡减少。我们的研究结果说明,经典Notch信号途径通过其下游分子Hes5协助STAT3的激活,进而引起MnSOD表达上调,降低细胞内ROS水平,在IRI中对肝细胞起到保护性作用。【结论】 1. Notch信号通路在肝脏IRI中发挥重要作用,Notch信号缺失会引起肝脏IRI加重。 2.肝细胞是Notch信号调控肝脏IRI的细胞生物学基础,在骨髓细胞中阻断Notch信号对肝脏IRI无明显影响,肝细胞中阻断Notch信号引起IRI肝细胞凋亡增加。 3. Notch信号通过调控肝脏IRI中肝细胞内ROS水平影响肝脏IRI,Notch信号缺失引起肝脏IRI中肝细胞ROS水平升高。 4. Notch信号通过其下游分子Hes5影响STAT3的激活,进而调控MnSOD的表达,最终影响细胞内ROS水平,Notch信号缺失引起Hes5-STAT3复合物水平下降,MnSOD表达下调,ROS清除减少。 5.体外激活肝细胞Notch信号对IRI起到保护性作用,激活肝细胞Notch信号引起IRI细胞凋亡减少。众多细胞、分子参与了肝脏IRI的调控,而我们的研究发现Notch信号途径通过Hes5影响STAT3的激活调控MnSOD的表达对肝脏IRI发挥保护性作用。我们首次报道了Notch-Hes5-STAT3-MnSOD分子调控轴,开辟了肝脏IRI分子调控机制研究的新的领域,为肝脏IRI的临床预防和治疗提供理论基础,同时也为众多ROS相关疾病,如:肿瘤、自身免疫性疾病的相关研究提供了新的思路。
【学位单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2011
【中图分类】：R575
【部分图文】：

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图 1. 细胞内 ROS 的产生和清除机制② ROS 的损伤作用细胞内蓄积的过多的 ROS 可以直接损伤细胞，其损伤机制包括：（OS 对细胞膜双层磷脂结构中重要脂类进行氧化作用，改变膜的完整性和性，生成多种毒性很强的脂质过氧化物，从而直接损伤细胞；（2）ROS直接氧化肝细胞核内 DNA 双链结构，引起 DNA 突变而造成肝脏结功能的损伤[54, 55]；（3）ROS 通过直接作用于肝窦内皮细胞膜增加血及中性粒细胞的粘附位点和激活磷脂酶 A2 催化膜表面的磷脂成分产小板激活因子及白三烯，对肝窦内皮细胞结构和功能进行破坏而损伤肝；（4）ROS 抑制线粒体的氧化磷酸化，使能量物质减少；（5）ROS引发一系列复杂的生物活性分子的产生和反应，如吞噬细胞激活、内毒释放、补体激活、花生四烯酸代谢激活(生成前列腺素、血栓素)等而造

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等在应激状况下都可以表达 iNOS，肝脏 IRI 过程中 NF-κB 激活下游 iNOS 的表达[75]。应激状况下 iNOS 产生的 NO 远远多S, 因此，iNOS 是肝脏 IRI 中 NO 的主要来源。关于 NO 在肝脏 I作用尚存在争议，一方面，NO 具有舒张血管，改善微循环的作用，肝脏损伤起到保护性作用[76]。另一方面 NO 在大量氧自由基存在下氧化成过氧亚硝酸（ONOO-），可以直接使蛋白发生硝基化，直接损，是效价很高的细胞凋亡诱导剂[77]。此外，Takashi, H. [78]证实，iNO的 NO 对于 MMP-9 的活化至关重要，iNOS 的剔除会导致肝脏 IMP-9 活性下降，白细胞迁移障碍，最终 IRI 损伤减轻。之，在以上各种因子介导下凋亡坏死的细胞，引发了肝脏局部的激症反应，这种反应被逐步放大，对肝细胞造成进一步的损伤[79]，如

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图 3. 肝脏 IRI 中性粒细胞浸润肝脏组织损伤肝细胞机制，来自参考文献[88]3. 参与肝脏 IRI 的信号通路1）细胞存活相关信号途径肝脏 IRI 涉及细胞存活，细胞损伤后的恢复，免疫细胞的激活，相关因子的产生释放等过程，众多信号分子通路被证实参与其中，共同构成分子网络发挥重要调控作用。IR 可以激活 MAPK 途径下游 p38 和 JNK[89-91]。给予 p38/JNK 激动剂加重肝脏 IRI，而 MAPK 抑制剂的应用则可以减轻IRI [92]。PI3K/Akt 信号通路作为重要的细胞存活信号，在 IRI 中也扮演着重要角色，存活激酶 Akt 可以使凋亡信号途径中的一系列分子发生磷酸化，例如 BAD、FOXO、IκB kinase、GSK-3β 等，从而在 IRI 中对细胞起到保护作用[93]。2）炎症信号通路

【参考文献】