拉米夫定耐药患者的临床特点及耐药毒株的分子病毒学研究

发布时间：2020-09-16 09:47

　　随着以拉米夫定为代表的新一代核苷类似物在我国慢性乙型肝炎患者中的广泛应用，核苷类似物耐药成为目前临床关注的焦点问题。我们对在我科接受拉米夫定治疗的247例慢性乙型肝炎患者进行跟踪随访，每三个月检测一次患者肝功能和病毒学指标，发现拉米夫定治疗6个月，94％患者HBV DNA降至1×10~5copies／ml以下，76％患者ALT转为正常(小于1倍ULN)，HBeAg累积血清学转换率随着治疗时间的延长逐渐增高，1年为16.08％，2年为33.75％，3年为47.00％。治疗前ALT水平高于3×ULN者发生血清学转换比例明显高于低于3×ULN者(P=0.0316)。因此在选择治疗病例时应尽量选择治疗前ALT超过3×ULN者，以期获得更好的持续应答。随着拉米夫定用药时间的延长，YMDD变异的累积发生率逐渐增高，YMDD变异的累积发生率在治疗1年时为8.33％，治疗2年为25.79％，治疗3年为41.30％，治疗4年为51.97％。治疗前HBV DNA水平高于25pg／ml者YMDD变异发生率明显高于DNA水平低于25pg／ml者(P=0.0224)。在出现YMDD变异的42例患者中，有32例患者表现有肝功能的异常(超过2倍ULN)，35例患者出现HBV DNA反跳(超过1×10~5拷贝／ml)，但发生YMDD变异患者平均HBV DNA水平仍远低于治疗前HBV DNA水平，ALT、AST水平与治疗前相比无明显差异。出现YMDD变异后，HBeAg阳性患者ALT上升的最高值较HBeAg阴性患者明显较高，这可能与HBeAg阳性患者原有的疾病活动程度较高有关。从我们的研究结果看，拉米夫定具有较强的抗病毒作用，患者可在较短的时间内获得病毒学和生化应答，长期治疗还可获得HBeAg血清学转换，从而减少停药后复发的机会。但拉米夫定长期治疗过程中耐药性的产生及由此引发部分患者肝功能和病毒水平的反跳应引起临床医生的密切关注。在决定是否延长拉米夫治疗期限时要权衡延长治疗带来的抗病毒效果与耐药性的产生可能带来的病情复发之间的利弊关系。我们采用本室先前建立的RFLP方法筛检YMDD变异并将其应用于临床监测拉米夫定治疗过程中耐药性的产生，取得了较好的效果。由于RFLP的局限性，我们对筛检YMDD变异阳性的标本进行了P基因测序，以进一步了解拉米夫定耐药株的P基因A-E区序列特点。结果显示，DNA测序的结果与RFLP筛检的结果完全吻合，证明RFLP是简便、可靠的。我们的研究中YVDD变异较少伴有rtL 180M点突变，这是否同中国感染的HBV毒株的基因型有关目前尚不清楚，需要扩大样本量才能得出可信的结论。为更详细了解P基因YMDD以外的突变，对19例患者 P基因A一E区进行测序，发现19例患者中有10例除了发生YMDD变异外还有P 基因A一E区其他部位氨基酸的突变，有5种点突变同时在2个以上的患者中发生，包括rtL80I，rtV84M，rtG172E，找C174C和rtG172E/rtG174C联合突变，这几种突变在参考序列中未发现(已经与GeneBank中202株HBv全序列进行对比).rtL80I， rtV84M变异与YMDD变异同时发生，形成YMDD的伴随突变。而rtG172E，rtG174C 和rtG 1 72E/rtG174C变异多单独存在，较少与YMOD变异同时发生，可能有一定的临床意义。但这些位点的突变是否与核普类似物耐药有直接关系还有待体外实验进一步证实。由于S基因与P基因完全重叠，因此P基因核普酸的改变可能会影响到S基因的表达，P基因YMDD变异中YVDD变异引起S基因1195M的改变，而YIDD变异则引起S基因W196L或W1965的改变。本研究中还有2例患者中分别因为P基因rt083N和rtMZo4I变异导致HBsAg的表达提前出现终止，但患者仍表现为HBsAg阳性，说明在患者中这种提前终止的变异株均与野毒株同时存在。为进一步研究变异毒株的生物学意义，我们通过定向点突变，成功的在模板 P3.Sll的基础上构建了五种P基因变异株，并在此基础上将包含不同突变点的全基因质粒通过磷酸钙转染的方法转染HePGZ细胞。通过转染细胞上清的检测结果发现，五种不同的P基因变异株均可表达并分泌HBsAg和HBeAg，证明转染质粒在细胞内可正常表达和分泌，但五种变异株与野株相比，S加值相差不多，说明这五种P基因变异对S基因表达的抗原并无明显影响。转染后的细胞内核心颗粒DNA 通过Rea卜Time PCR检测的初步结果提示，YMDD变异株的复制活性只有野毒株的1/10，而rtG172E和rtG174C变异株的复制活性也较野毒株下降，联合变异 rtG 1 72E/rt G174C复制活性下降更为明显。但要最终确定病毒复制活性的变化，下一步还需要用Southern Blot进一步验证。
【学位单位】：中国人民解放军第一军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2003
【中图分类】：R512.62

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