PKG-1对非酒精性脂肪肝的保护作用

发布时间：2020-09-16 21:32

　　背景:非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是目前最常见的肝脏疾病,是其它慢性肝病的形成主要原因,NAFLD进一步发展会导致非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝硬化和肝细胞癌的发生。在世界范围内,NAFLD患病率约为25%,其中南美洲(31%)和中东(32%)发病率最高,其次是亚洲(27%),美国(24%)和欧洲(23%);而NAFLD在非洲比较少见(14%)。该病是一种与肥胖、糖尿病密切相关的慢性肝脏疾病,在中国的发病率高达15-20%,对国民经济发展造成沉重负担。目前尚无用于治疗NAFLD的药物,因此深入研究NAFLD发病机制,开发相关药物成为了一个重要的课题。蛋白激酶G(PKG)是丝氨酸/酪氨酸特异性激酶,是cGMP信号的主要作用因子。在转录水平上,一系列因子被发现对PKG1的表达具有调控作用,如Sp1/Sp3,KLF4,p53,FoxO1,USF1/2和RhoA等,它们大多与NO/环核苷酸途经相关。我们以前的研究证实,过表达蛋白激酶G-1(PKG-1)能调节高脂饲料诱导的肥胖小鼠的脂质代谢,降低脂质在小鼠体内的储积,而肥胖常常伴随着NAFLD的发生,但是PKG-1对NAFLD的作用机制尚不明确,因此本研究应用小鼠单纯肥胖并发晚期糖尿病动物模型,通过生物化学与分子生物学的技术手段对PKG1基因调控非酒精性脂肪肝的效应及分子机理进行研究,为研究开发与PKG1相关的治疗NAFLD的药物提供实验支持。目的:探索PKG-1对非酒精性脂肪肝的作用及其作用机制。方法:1.小鼠脂肪肝模型的建立及实验分组实验小鼠分为四组:ob~(-/-)CD~+组、ob~(+/-)CD~+组、ob~(-/-)CD~-组和ob~(-/-)CD~-组。ob~(-/-)组小鼠为obese基因隐形纯合小鼠,该小鼠食物摄入量大,易肥胖,是常作II型糖尿病研究的动物模型。ob~(+/-)小鼠为ob~(-/-)小鼠与野生型小鼠杂交繁育而成。CD~+组小鼠为PKG-1基因过表达的小鼠,为美国肯塔基大学营养学院王淑霞教授实验室原有小鼠,通过CD~+小鼠与ob~(-/-)小鼠杂交获得,经过基因型鉴定后分为ob~(-/-)CD~+、ob~(+/-)CD~+、ob~(-/-)CD~-和ob~(+/-)CD~-四组小鼠,选择每组6只雌性小鼠进行实验。2.小鼠肝脏称重及肝脏指数的计算在小鼠20周龄时称取小鼠的体重,解剖小鼠并称取肝脏的湿重,用小鼠的肝脏重量除以小鼠体重得出肝脏指数。3.小鼠肝脏组织形态学观察小鼠肝脏组织用10%的福尔马林固定后,石蜡包埋,在制成石蜡切片后进行HE染色,显微镜下观察肝脏组织的结构;肝脏组织的纤维化程度是通过masson染色和Sirius red染色后,显微镜下观察胶原纤维的分布来确定的。4.小鼠肥胖及纤维化相关基因转录水平检测采用qPCR方法检测与脂肪合成降解相关基因,如CPT1A、PGC1α、PPAR GAMA、SREBP和FASN,及纤维化相关基因,如CollagenI/III/IV、TGF-b、Fibronectin的转录水平。结果:1.PKG-1过表达可以明显改善小鼠脂肪肝程度。在ob~(-/-)纯合肥胖模型中,过表达PKG-1小鼠与非过表达PKG-1小鼠相比,体重与肝指数均显著降低,TG与蛋白总含量比值也显著降低。HE染色表明,过表达PKG-1小鼠与非过表达PKG-1小鼠相比,脂肪空泡明显减少,且肝脏组织结构较为完整。以上结果表明,PKG-1过表达可以显著改善肥胖模型小鼠的脂肪肝程度。2.PKG-1过表达下调脂肪降解、脂肪合成及游离脂肪酸吸收的相关基因表达。在肥胖模型中,过表达PKG-1小鼠与非过表达PKG-1小鼠相比,脂肪氧化分解的相关基因CPT1a与PGC1α,脂肪合成的相关基因PPAR GAMA、SREBP和FASN,游离脂肪酸吸收的相关基因CD36、FATP2和FATP5,均显著下调。说明PKG-1过表达调控下游脂肪降解、合成及游离脂肪酸吸收的转换过程。3.PKG-1过表达减弱了肝脏细胞中的炎症反应。在肥胖模型中,过表达PKG-1小鼠与非过表达PKG-1小鼠相比,炎症因子IL-6和TNF-α均显著下调。过表达PKG-1引起炎症反应减弱可能与脂肪减少相关。4.PKG-1过表达能够显著抑制肝脏组织纤维化。在肥胖模型小鼠中,与非过表达PKG-1小鼠相比,过表达PKG-1小鼠肝脏组织中的胶原染色较弱。另外肝细胞纤维化相关基因CollagenI/III/IV和Fibronectin,与非过表达PKG-1小鼠比,PKG-1过表达组小鼠肝脏中的上述基因表达水平显著降低。以上结果表明,PKG-1过表达显著抑制肝脏组织的纤维化。结论:1.在obese基因缺失组小鼠中,PKG-1过表达显著降低非酒精性脂肪肝的脂肪积累水平。2.过表达PKG-1可以改善肝脏纤维化的程度。3.过表达PKG-1可能通过降低肝脏炎症反应来保护非酒精性脂肪肝。
【学位单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R575.5
【部分图文】：

脂肪含量,小鼠,肝指数,过表达

2.1 PKG-1 过表达降低肥胖小鼠肝脏脂肪含量我们通过带有隐形纯合子 ob 基因(ob-/-)的小鼠建立单纯肥胖模型，解剖后与 ob 基因杂合子小鼠的体重、肝脏重量、肝指数相比较，结果如图 2.1 所示，ob-/-小鼠的肝脏重量明显高于 ob+/-小鼠肝脏的的重量（a），ob-/-小鼠的肝指数明显高于 ob+/-小鼠的肝指数（b），ob-/-小鼠肝脏中 TG 与蛋白总量的百分比显著高于 ob+/-小鼠的百分比（c）。因此，ob-/-小鼠组肝脏脂肪含量高于 ob+/-小鼠。在 ob-/-小鼠中分别有 PKG-1 过表达组（CD+）和非过表达 PKG-1 组（CD-），对该两组小鼠的肝脏称重并除以相应小鼠的体重，我们发现 CD+组小鼠的肝重与肝指数明显低于 CD-组小鼠，说明 PKG-1 过表达在小鼠肝脏脂肪含量降低过程中具有重要作用，如图 2.1（a）和（b）。通过提取并测定 ob-/-小鼠中CD+组小鼠和 CD-组小鼠肝脏 TG 含量，发现 CD+组小鼠的 TG 含量与蛋白总量百分比显著低于 CD-组小鼠（c）。但是，ob+/-小鼠中，无论 PKG-1 基因是否过表达，对肝指数和肝脏中 TG/蛋白含量的影响并不明显。

显微照片,组织切片,HE染色,小鼠

PKG-1 对非酒精性脂肪肝的保护作用小鼠的肝脏重量、肝指数、TG/蛋白百分比明显低于 CD-组小鼠。*P<0.05 PKG-1 过表达对肥胖诱导的小鼠脂肪肝有明显改善作肝脏组织切片进行 HE 染色后，显微照片显示 ob-/-组小鼠肝脏中ob+/-组小鼠的，多数肝脏细胞的细胞核位于一侧，这是细胞核被脂滴色时脂肪被溶解，肝脏细胞脂滴形成的空泡很干净，可以清晰地 2.2）。对比 ob-/-组小鼠中，ob--CD+小鼠的脂肪空泡明显少于 ob--结构较为完整。在 ob+/-组小鼠中，ob+-CD+小鼠和 ob+-CD-小鼠整整，很少出现脂肪空泡（图 2.2）。O

β-氧化,过表达,小鼠

2.3.1 PKG-1 过表达对肝脏脂肪β-氧化相关基因表达的影响脂肪氧化分解可以降低肝脏中脂肪的含量，脂肪β-氧化是生物体内常见的一种氧化机制，在脂肪β-氧化过程中 CPT1A、PGC1α的表达量是一个及其重要直观的评价因素。在小鼠体细胞中，CPT1A、PGC1α的表达量增加，可以增加肌肉葡萄糖转运子-4 的表达从而增强葡萄糖的转运，并且增加脂肪酸氧化酶的转录活性使脂肪酸β-氧化速率增加。CPT1A 是肉碱依赖性转运线粒体膜内的关键酶，其缺乏导致脂肪酸β氧化率降低。如图2.3.1 所示，qPCR 测定小鼠肝脏细胞 CPT1A、PGC1α基因的表达，结果表明，在 ob-/-且 PKG-1 过表达组小鼠 CPT1A、PGC1α 相对表达量有明显差异。ob-/-组小鼠中，CD+组小鼠，CPT1A 表达量低于 CD-组小鼠，PGC1α表达量低于 CD-组小鼠。在 ob+/-小鼠组中 CPT1a、PGC1α表达量无显著差别。在 ob-/-组小鼠中 CD+组小鼠 CPT1A 表达量低于CD-组小鼠，PGC1α表达量低于 CD-组小鼠，说明 PKG-1 的过表达对脂肪β-氧化有抑制作用，但是在 ob+/-组小鼠中，CPT1A 和 PGC1α的表达无显著差异。

【参考文献】