胆红素与5-羟色胺3A受体的氢键结合增高阻塞性黄疸的痛阈

发布时间：2020-09-22 08:34

　　 研究目的阻塞性黄疸是一种由于各种原因导致的肝内外胆管阻塞,胆汁无法通过正常通道排出而淤积在体内所致的一种临床症状,常见于肝内外肿瘤、胰头肿瘤、结石嵌顿等疾病,肝功能在一定程度受到损害,机体发生复杂的病理生理改变。阻塞性黄疸存在特殊的痛觉现象,对伤害性刺激不敏感即痛阈增高。在临床工作中痛阈增高容易导致患者就诊延迟、围术期麻醉镇痛药物使用相对过量、呼吸抑制、苏醒延迟等,不利于病人术后恢复。本课题的目的是探索黄疸患者中枢增高的胆红素(Bilirubin)通过与脊髓背角的5-羟色胺3A(5-hydroxytryptamine 3A,5-HT_(3A))受体结合激活γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)能神经元,通过促进抑制性递质GABA的合成释放和增强GABA神经元抑制性活动介导阻塞性黄疸的痛阈增高。研究方法1、通过胆总管结扎(bile duct ligation,BDL)创建阻塞性黄疸的模型,采用全自动生化分析仪分析血清和脑脊液中肝功能各项指标的改变。BDL和胆红素鞘内注射测定Sprague-Dawley(SD)大鼠的痛阈。BDL、胆红素鞘内注射和脊髓背角神经元培养后,通过western blot的方法观察5-HT3受体各亚型的表达变化,并通过免疫荧光观察BDL后脊髓切片神经元激活情况和5-HT_(3A)受体表达变化。2、通过鞘内注射5-HT_(3A)受体拮抗剂、GABAA受体拮抗剂、GABAB受体拮抗剂后测定BDL大鼠痛阈的变化。脊髓背角神经元培养鉴定GABA能神经元上5-HT_(3A)受体的表达情况,并进一步通过western blot的方法观察BDL、胆红素鞘内注射和脊髓背角神经元培养胆红素干预后GABA受体各亚型的表达变化,并通过酶联免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)测定脑脊液内GABA浓度。电生理技术记录5-HT_(3A)受体激动剂和胆红素对脊髓背角GABA能抑制性突触后电流(spontaneous inhibitory postsynaptic current,s IPSC)的影响以及应用5-HT_(3A)受体拮抗剂后电流变化。3、通过慢病毒将携带目的基因的质粒转染进入人胚肾293细胞(human embryonic kidney 293,HEK293)构建过表达人5-HT_(3A)受体的HEK293细胞(HEK293-5-HT_(3A)),电生理膜片钳观察胆红素和5-HT_(3A)受体激动剂对细胞内向电流的影响。放射性配基结合实验测定胆红素和5-HT_(3A)受体的亲和力大小,并通过同源建模和分子对接的方法模拟预测胆红素和5-HT_(3A)受体的空间结构、结合方式以及结合位点。结果1、胆总管结扎术后大鼠血浆总胆红素(total bilirubin,TB)、直接胆红素(direct bilirubin,DB)和间接胆红素(indirect bilirubin,IB)、胆汁酸(total bile acid,TBA)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)均随着BDL时间增加而增加,而脑脊液中仅有TB和IB升高,且在3、5、7天显著高于sham组。BDL后大鼠机械痛阈和热痛阈显著升高,鞘内直接注射胆红素后大鼠机械性痛阈和热痛阈显著高于注射前。BDL3d大鼠鞘内注射昂丹司琼抑制了胆总管结扎大鼠的痛阈升高,且具有浓度依赖性。BDL、胆红素鞘内注射以及胆红素直接培养大鼠脊髓背角神经元后5-HT_(3A)受体表达逐渐增加。免疫荧光显示BDL后5-HT_(3A)受体表达高于假手术组,且活化的神经元数量增加,活化的神经元同时高表达5-HT_(3A)受体。2、鞘内给予昂丹司琼(ondansetron)、荷包牡丹碱(bicuculline)显著降低黄疸大鼠的痛阈,而CGP55845对痛阈的降低作用较弱。且昂丹司琼、荷包牡丹碱抑制了鞘内注射5-HT_(3A)受体激动剂m CPBG、胆红素诱导的痛阈增高。脊髓背角神经元培养免疫荧光染色显示培养的GABA能中间神经元多数表达5-HT_(3A)受体,且BDL、胆红素鞘内注射大鼠以及胆红素直接培养脊髓背角神经元后GABAA受体表达增加,昂丹司琼在一定程度抑制GABAA受体的表达。ELISA提示BDL和胆红素鞘内注射后脑脊液内GABA浓度明显增加,昂丹司琼干预后GABA水平有短暂下降。电生理记录提示m CPBG、胆红素增强GABA能神经元的s IPSC,而昂丹司琼干预后m CPBG、胆红素对s IPSC的作用减弱。3、胆红素诱发HEK293-5-HT_(3A)细胞产生内向电流。放射性配基结合实验证实胆红素同5-HT_(3A)受体有较弱的亲和力,两者以能量较低的方式相结合。胆红素能够进入5-HT_(3A)受体亚基之间形成的疏水间隙,两者在空间结构上具有良好的互补性,并且有氢键形成。结论本研究可得出如下结论:1、胆红素通过5-HT_(3A)受体增高阻塞性黄疸的痛阈。BDL后大鼠机械性痛阈和热痛阈显著升高,且脑脊液内胆红素水平增加。鞘内注射胆红素同样增加大鼠痛阈,且可被5-HT_(3A)受体拮抗剂所抑制。同时5-HT_(3A)受体在胆红素干预后表达明显增加,且脊髓背角神经元活性增加。2、胆红素通过5-HT_(3A)受体影响GABA通路的功能。5-HT_(3A)受体激动剂、胆红素鞘内注射均可增高大鼠痛阈,这种效应可被5-HT_(3A)受体拮抗剂、GABA受体拮抗剂所抑制。同时,5-HT_(3A)受体在培养的脊髓背角GABA能神经元上大量表达,且GABAA受体在胆红素干预后蛋白表达明显增加,GABA浓度在BDL和胆红素鞘内注射后显著增加。3、胆红素与5-HT_(3A)受体以氢键相结合。胆红素能够诱发HEK293-5-HT_(3A)细胞产生内向电流,且放射性配基结合实验证实胆红素同5-HT_(3A)受体的亲和力较弱,提示两者以共价键或离子键等结合的可能性较小。同源建模和分子对接进一步证实了胆红素能够进入5-HT_(3A)受体两个亚基之间形成的疏水间隙,两者在空间结构上具有良好的互补性,并且有氢键形成。阻塞性黄疸中枢升高的游离胆红素能够与脊髓背角的5-HT_(3A)受体以氢键相结合,从而增强GABA能中间神经元的活动,参与黄疸患者的痛阈增高。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R575
【部分图文】：

图 1 Von Frey 尖端足底刺激位点rn blot 蛋白测定提取：大鼠腹腔注射 2%的戊巴比妥钠深氮中速冻。称取适量组织加入 RIPA 裂裂解 1h，并在 4℃条件下 12000rpm 离元培养的蛋白提取：弃去六孔板内培养入 RIPA 裂解液后放置于冰上，用刮，并在低温离心机 15000rpm 离心 20m白浓度：取 96 孔板，将配好的一定浓取 5μl 分别加入孔内，并用去离子水补℃条件下孵育 10min 后，用酶标仪测定

图 2 BDL 后胆总管变化肝功能各指标变化。TB、DB、IB、TBA、ALT、AS05 同 sham 组相比）DB(μmol/L) IB(μmol/L) TBA(μmol/L) 0.53±0.11 0.2±0.07 8.25±0.83 37.83±6.63* 1.9±0.64 178±12.5* 77.05±8.03* 13.1±3.09* 117.18±8.06* 56.8±11.86* 9.9±3.03* 87.73±10* 79.8±6.6* 14.03±1.88* 104.43±4.81* 液的生化结果显示，BDL 后大鼠脑脊液内游离胆

图 3 胆红素通过 5-HT3A受体影响大鼠痛阈。A：BDL 术后机械性痛阈显著增高。B：BDL 后热痛阈显著升高。C：BDL 术后脑脊液内游离胆红素显著升高，第三天达到峰值且维持在稳定水平。D：鞘内注射不同浓度胆红素 20min 后脑脊液内胆红素浓度有明显增加，鞘内给药成功。E：鞘内给予胆红素后机械性痛阈增加。F：鞘内给予胆红素后热痛阈增加。G：在 BDL3d 的大鼠鞘内注射不同剂量 5-HT3A受体拮抗剂昂丹司琼后，黄疸大鼠升高的痛阈不同程度被抑制，且具有剂量依赖性。（三）5-HT3受体各亚基表达变化为了进一步探究 5-HT3A受体在阻塞性黄疸大鼠痛阈升高中的作用，我们进一步用 Western blot 方法检测 BDL 大鼠、胆红素鞘内注射大鼠以及胆红素直接培养大鼠脊髓背角神经元后 5-HT3受体各亚基的表达变化。结果显示，BDL 术后脊髓膨大段5-HT3A受体表达逐渐增加，在第三天表达显著增高且稳定（P<0.05），而 5-HT3B、5-HT3C、5-HT3D、5-HT3E的表达则无显著改变（图 4A、4B）。同样，鞘内注射 1000μM胆红素后 5-HT3A受体同样有显著增加（P<0.05），而 5-HT3B、5-HT3C、5-HT3D、5-HT3E

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本文编号：2824150