一、研究背景和目的 β-连环蛋白(β-catenin)是Wnt信号通路中至关重要的成员之一,对细胞的生长、再生、分化等起重要的调节作用。胞浆中的β-catenin分子在受到Wnt配体的刺激后与转录因子Tcf4/Lef结合形成转录复合物转运入核,启动下游靶基因如c-Myc、CyclinD1、Survivin等的转录和表达,调节细胞的生长和凋亡。同时,β-catenin又与跨膜黏附分子钙黏附素(cadherin)相连,参与细胞黏附。肝脏的众多生理和病理过程与Wnt/β-catenin信号通路,尤其是β-catenin基因的异常改变密切相关。β-catenin对于肝脏发育、肝细胞的增殖和凋亡具有重要调节作用,肝细胞癌和肝胚细胞瘤也与β-catenin的异常改变有关。然而,Wnt/β-catenin信号通路,尤其是β-catenin在急性肝损伤中的主要作用尚未明确。 急性肝损伤是一种非常严重的临床综合征,死亡率很高。自身免疫性肝炎、病毒性肝炎、大量饮酒和应用肝毒性药物是其诱因。大量肝细胞坏死和凋亡是急性肝损伤过程中十分重要的病理学特征。Fas是介导凋亡信号通路的细胞表面抗原,当与特异的配体或抗体结合后可以启动半胱天冬酶级联,导致细胞凋亡。小鼠给予抗Fas抗体(Jo2)后可通过诱导大量的细胞凋亡而引起死亡。细菌脂多糖(LPS)是一种强诱导物,可促进巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和一氧化氮(NO),诱导由氧化应激介导的急性肝损伤。D-半乳糖胺(D-GalN)可以增强啮齿类动物肝脏对LPS刺激的敏感性,LPS联合D-GalN可诱导小鼠急性肝损伤。 本实验将运用肝细胞特异性敲除β-catenin的基因敲除小鼠分别建立抗-Fas抗体和LPS/D-GalN诱导的小鼠实验性急性肝损伤模型,分别研究β-catenin在两种急性肝损伤模型中的作用。 二、材料和方法 1.从美国Jackson实验室引进B6.129-Ctnnb1tm2Kem/KnwJ(在β-catenin基因的内含子1和6中有Lox P位点)和B6.Cg-Tg(Alb-cre)21Mgn/J(有白蛋白增强子/启动子支配的Cre)小鼠,通过两种小鼠的2次杂交,繁育出肝细胞特异性敲除β-catenin(β-catenin KO)的小鼠并从基因表型(PCR)和肝细胞β-catenin蛋白表达水平以及免疫组化(抗β-catenin抗体)三方面进行鉴定。2.选择雄性6-8周龄,体重约18-23g Alb-cre;β-cateninloxP/loxP小鼠,随机分为Jo2处理组(n=6)、LPS/D-GalN处理组(n=6)和未处理组(n=4)。同窝Alb-cre;β-cateninloxP/+,β-cateninloxP/+,β-cateninloxP/loxP共同做为对照组(Control),随机分为Jo2处理组(n=7)、LPS/D-GalN处理组(n=6)和未处理组(n=4)。Jo2处理组腹腔注射Jo2(0.5ug/g体重),LPS处理组腹腔注射LPS(80ug/g体重)+D-GalN(800ug/g体重)。处理组于注射后6h脱颈处死,同时处死未处理组。3.留取血清和肝组织标本,(1)通过检测血清转氨酶水平,HE染色研究肝细胞特异性敲除β-catenin对Jo2和LPS/D-GalN诱导的肝损伤程度的影响。(2)通过Real-time PCR检测炎性因子(TNF-α、IL-6、IFN-γ)的水平,研究肝细胞特异性敲除β-catenin对Jo2和LPS/D-GalN诱导的肝损伤炎症反应的影响。(3)、应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测肝细胞凋亡情况,用Western blot方法检测肝细胞凋亡相关信号通路关键分子(Caspase-3、PARP、Bcl-2)的水平,通过免疫组化的方法检测P65表达,研究肝细胞特异性敲除β-catenin对Jo2和LPS/D-GalN诱导的肝损伤中肝细胞凋亡情况以及凋亡相关信号分子的改变情况。(4)检测LPS/ D-GalN刺激后肝组织iNOS和GSH的表达水平,研究肝细胞特异性敲除β-catenin对氧化应激的影响.4.应用SPSS统计软件对结果进行统计分析。 三、结果 1.繁育出肝细胞特异性敲除β-catenin小鼠。对转基因小鼠的基因表型鉴定,肝细胞特异性敲除β-catenin小鼠的基因表型为:ctnnb纯合(-/-)并且Alb-Cre阳性表达。免疫组化方面,野生型小鼠肝组织中内皮细胞和肝细胞表达β-catenin;肝细胞特异性敲除β-catenin小鼠的肝脏仅在内皮细胞的细胞膜上有β-catenin染色,肝细胞未发现β-Catenin染色。应用抗-β-catenin抗体进行Western Blot分析证明肝细胞特异性敲除β-catenin基因的小鼠肝脏β-catenin基因表达水平明显低于野生型。 2.在Jo2诱导的急性肝损伤模型中,β-catenin KO组小鼠血清ALT、AST水平明显高于对照组,P0.05;实时定量PCR结果显示IL-6、IFN-γ水平略高于Control组; HE染色结果(200X)见β-catenin KO组窦状隙明显膨胀、充血,肝细胞大片嗜酸性坏死,局灶出血,小叶结构紊乱,少量淋巴细胞和中性粒细胞浸润;Control组见窦状隙轻微肿胀、充血,少量肝细胞呈嗜酸性变和坏死,小叶结构尚完整,局灶出血,散在淋巴细胞和中性粒细胞浸润。免疫组化结果β-catenin KO组核阳性的p65染色少于Control组。TUNEL法检测细胞凋亡可见每高倍视野β-catenin KO组凋亡细胞个数明显高于Control组(P0.05)。Western Blot检测发现β-catenin KO组活化的Caspase-3、PARP表达高于Control组,Bcl-2水平低于对照组。 3.在LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤模型中,β-catenin KO组血清ALT、AST水平明显低于对照组(P0.05);实时定量PCR结果显示β-catenin KO组IL-6、iNOS水平略低于Control组,Bcl-xL水平高于对照组; HE染色结果(200X)见β-catenin KO组窦状隙散在膨胀、充血,炎细胞浸润,肝细胞片状嗜酸性坏死,局灶出血;Control组见窦状隙严重肿胀、充血,大片状肝细胞坏死,炎细胞浸润,肝小叶结构紊乱。免疫组化结果β-catenin KO核阳性的p65染色同Control组相比无明显差别。TUNEL法检测细胞凋亡可见每高倍视野β-catenin KO组凋亡细胞个数明显低于Control组(P0.05)。Western Blot检测发现β-catenin KO组Caspase-3、PARP表达低于Control组,Bcl-2表达高于对照组。肝组织GSH检测发现β-catenin KO组GSH水平高于Control组。 四、结论 1.肝细胞特异性β-catenin基因敲除小鼠在Jo2诱导的急性肝损伤过程中肝损伤程度明显高于对照组,提示β-catenin基因对Fas介导的肝细胞凋亡起保护作用,其机制可能与β-catenin基因的抗凋亡作用有关。 2.肝细胞特异性β-catenin基因敲除小鼠在LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤过程中肝损伤程度明显低于对照组,提示β-catenin基因可加重由LPS/D-GalN引起的肝损伤,其机制可能是β-catenin参与了LPS/D-GalN诱导的氧化应激导致急性肝损伤。
【学位单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2009
【中图分类】：R575
【部分图文】：
为：ctnnb 纯合（loxP/loxP）并且 Alb-Cre 阳性表达（图1.A）。应用 Western blot 方法分别检测野生型和肝细胞特异性敲除β-catenin 小鼠的肝组织蛋白，证实野生型小鼠肝组织β-catenin 蛋白表达丰度明显高于肝细胞特异性敲除β-catenin 小鼠（图 1.B）。应用抗β-catenin 抗体对野生型和肝细胞特异性敲除β-catenin 小鼠的肝组织分别行免疫组织化学染色，发现在野生型小鼠的肝组织中，内皮细胞和肝细胞均表达β-catenin；而肝细胞特异性敲除β-catenin 小鼠的肝组织中，仅在内皮细胞的细胞膜上有β-catenin 染色，肝细胞未发现β-catenin 染色，进一步证实实现了肝细胞特异性敲除了β-catenin（图 1.C）。图 1.肝细胞特异性敲除β-catenin小鼠的鉴定。A.基因表型鉴定：肝细胞特异性敲除β-catenin小鼠的基因表形如图A第 1.2 泳道所示，Alb-cre阳性表达，ctnnbloxP/loxP.；B.western blot检
第二军医大学 2006 级硕士学位论文非实质细胞都表达β-catenin，而肝细胞特异性敲除β-catenin的小鼠肝细胞中不表达-catenin，仅在细胞膜上有少量β-catenin表达。二、肝细胞特异性敲除β-catenin 导致肝脏体积减小。有研究表明β-catenin 对肝脏发育、肝细胞的增殖和凋亡具有重要调节作用经过称量小鼠体重、肝重，我们发现野生型小鼠和肝细胞特异性敲除β-catenin 鼠的体重无明显差别，而肝细胞特异性敲除β-catenin 小鼠的肝重以及肝重/体重值明显低于对照组（图 2），说明肝细胞特异性敲除β-catenin 导致肝脏体积减小。
图 3 肝细胞特异性敲除β-catenin 导致 Fas 诱导的肝损伤加重。A.小鼠血清 ALT 水平,处理组血清 ALT 水平显著高于未处理组,其中处理组β-catenin KO 组 ALT 水平显著高于 Control ;B.小鼠血清 AST 水平,处理组血清 AST 水平显著高于未处理组,处理后β-catenin KO 组血清 AST 水平显著高于 Control 组。数据用 Mean±SEM 表示。*P<0.05。
【共引文献】
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