B淋巴细胞是骨髓干细胞来源的免疫细胞,它依靠向血液和粘膜组织分泌抗体介导体液免疫,同时它也可以作为抗原提呈细胞向T细胞提供抗原和刺激信号,并激活T细胞使其发挥免疫效应。近年来,根据大量的文献报道,B细胞还具有负性调节作用,在多种自身免疫病和炎症中发挥着缓解疾病的作用；另一方面,B细胞的调节作用对于抗肿瘤免疫治疗的干扰也成为了肿瘤治疗领域的研究热点。但是,B细胞在疾病中负性调节作用的具体机制,还存在着巨大的争议。因此,在疾病中研究B细胞发挥负性调节作用的具体方式有着重要的意义。 1996年,Wolf等人发现相对于野生型(WT)小鼠,用B细胞缺陷的μMT小鼠建立的实验性脑脊髓膜炎模型(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE)出现了疾病极度恶化的状况,这为B细胞在疾病中具有缓解作用提供了有力证据。自此,B细胞缓解疾病的负性调节作用成为了免疫学家研究的热点,在多种动物模型和人类疾病中大量研究。目前,普遍接受的B细胞发挥调节作用的方式大致分为两种：1.在炎症和肿瘤疾病中,B细胞通过分泌IL-10等调节性细胞因子或者依靠分泌抗体发挥调节作用。2.B细胞通过同其他免疫调节细胞如调节性T细胞(Treg)相互协同发挥作用。但是,目前对于B细胞在炎症性肠病中调节作用的机制知之甚少。 炎症性肠病(Inflammation Bowel Disease,IBD)是一组以肠道炎性细胞浸润、肠粘膜受损为主要表现的肠道慢性炎症病变,它包含克罗恩氏病(Crohn disease,CD)和溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)两种疾病,全世界每年有10,000-50,000的新增病例。炎症性肠病病人可以表现出不可预测性肠道综合征,此外,肠炎病症还有发展成为肠癌的可能,因而对于炎症性肠病的研究愈来愈受到重视。肠道免疫系统对于肠道病原菌的过激反应被认为是炎症性肠病产生的原因之一,已有研究表明,在肠炎局部,巨噬细胞以及粒细胞等在肠道中大量浸润并且分泌IL-17,IL-6,TNF-α等细胞因子。而另一方面,在肠道免疫耐受系统中,存在着阻止病原菌接触肠道免疫系统并抑制过激性反应的免疫细胞和分子。文献报道,Treg和B细胞分泌的IgA大量存在于肠组织中,对于维持肠稳态至关重要,目前已有研究表明,Treg和B细胞的缺失会影响肠道疾病的转归。然而,对于这些缓解疾病的调节因素之间的关系以及它们促使疾病转归的具体方式尚未有系统性研究。 在此,我们以葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulfate Sodium, DSS)诱导的小鼠急性肠炎模型作为研究对象,就B细胞在炎症性肠病中的作用以及其与Treg在肠相关免疫系统中的相互关系展开了研究。这些问题的阐明将有助于“B细胞在肠炎中的调节作用”这一新领域的研究拓展,并为临床肠炎的干预和治疗提供了新视野。 第一部分B细胞负性调节DSS诱导的炎症性肠病的症状 如前所述,IBD分为两种疾病类型,溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。DSS诱导的小鼠肠道炎症是模拟人类溃疡性结肠炎的一种动物模型,广为认可。其病程可分为开始阶段即第0-3天,表现为粒细胞浸润,固有免疫系统开始激活；急性期即第4-9天,表现为粘膜损伤,肠道吸收停止,体重下降；以及疾病缓解期即10天以后,肠粘膜浸润的粒细胞开始减少,肠炎症状消退。DSS诱导的肠炎局限在大肠内,其疾病的主要症状为小鼠的大便性状改变,便中带血和体重减轻等,病理表现为全结肠粘膜层和粘膜下层的炎性细胞浸润和糜烂,杯状细胞缺失和粘膜固有层增厚。 据此,我们首先给予8-12周龄的小鼠2%的DSS,建立肠炎模型。然后在不同的时间点用流式细胞仪技术检测脾脏和肠相关免疫组织(Gut associated lymphoid tissue,GALT)中免疫细胞格局的变化。结果发现：急性炎症期外周免疫器官和肠相关免疫器官中B细胞的数量和比例变化明显,甚至在炎症开始的阶段B细胞的数量已有增高趋势,提示B细胞可能参与肠炎的疾病进程。 为进一步研究B细胞显著性变化在炎症性肠病中的意义。我们以上述模型为基础,利用基因敲除小鼠——μMT小鼠与体内中和抗体——抗CD20单克隆抗体,在B细胞缺陷的情况下诱导肠炎。通过称量小鼠体重,观察小鼠大便性状和病理切片,我们发现发现：和野生型(wild type,WT)小鼠相比,用B细胞缺陷的小鼠诱导的炎症性肠病,其症状更加严重,死亡率增高且几乎无缓解迹象。而向B细胞缺陷的小鼠体内过继性转输野生型小鼠B细胞之后再诱导疾病发生,病症有所减轻,并接近于野生型小鼠的症状和病理表现。 这些结果表明,B细胞在DSS诱导的炎症性肠病中,起到缓解疾病的作用。 第二部分Treg等参与B细胞介导的炎症性肠病的调节 目前的研究显示,IL-10依赖的方式是B细胞发挥负性调节作用的主要方式之一,在EAE、类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)模型等自身免疫性疾病中,均有研究证实其缓解疾病的方式主要依靠分泌IL-10。 因此,为了进一步探讨B细胞在本模型中负性调节的方式,我们检测了外周免疫器官脾脏和肠相关免疫器官(GALT)一一肠系膜淋巴结(mesenteric lymph nodes, MLN),派氏结(peyer's patch, PP),肠上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocyte,iEL),肠固有层淋巴细胞(Lamina propria lymphocyte,LPL)中B细胞IL-10的表达。结果发现,在肠炎阶段,IL-10分泌性B细胞的水平并没有增高。提示IL-10可能并未参与B细胞对炎症性肠病的负性调节作用。 为证实这一观点,我们同时向μMT小鼠体内转输了分别来自野生型小鼠和IL-10缺陷小鼠的B细胞,然后用DSS诱导炎症性肠病,结果发现,相对于未转输组,转输了IL-10缺陷小鼠来源的B细胞和转输了野生型小鼠B细胞同样可以缓解疾病的进程和症状。这进一步说明,在DSS诱导的炎症性肠病中,B细胞缓解疾病方式不是IL-10依赖性的。 近两年,关于B细胞非IL-10依赖性负性调节机制也有大量的研究,其中,受到广泛认可的是B细胞依靠与其他调节性细胞相互促进的方式发挥调节作用。因此,B细胞和在肠道免疫中发挥着关键作用的调节性T细胞(Regulatory T cells, Tregs)的关系成为了我们探索的目标。我们利用流式细胞仪技术检测了炎症期小鼠各脏器的Treg的表达,结果Tregs在疾病过程中数量有所增高,这提示了Treg可能影响了疾病的进程。更为重要的是,Treg变化和B细胞的变化呈正相关,因此,Treg可能参与了B细胞介导的炎症性肠病的抑制. 为了进一步证实这一观点,我们用流式细胞术检测了μMT小鼠各器官Treg的比例和数量,以及转输了B细胞后Treg数量的变化。结果显示,无论在健康还是肠炎的情况下,Treg的数量在IμMT小鼠大部分肠相关免疫细胞中均下降,而回输B细胞后,Treg数量回升,接近野生型小鼠的水平。 这部分结果表明,B细胞在DSS诱导的肠炎模型中的调节作用和Treg有关,而与IL-10的分泌无关。 第三部分B细胞与Treg在炎症微环境中的相互作用及机制 为了进一步明确B细胞维持Treg数量的机制,我们检测了Treg的增殖和向肠局部迁移的水平。结果显示Treg的增殖水平在μMT小鼠中减少,而在B细胞回输的实验组中增高,提示B细胞在体内有促进Treg增殖的作用。因此我们假设,在肠炎中B细胞通过促进Treg的增殖维持了Treg数量,从而使得Treg可以更好的缓解肠炎症状。 为了证实这一点,我们以T,B细胞缺陷小鼠Rag基因敲除小鼠为实验对象,向其过继性转输淋巴细胞,并建立DSS诱导的炎症模型。结果显示,所有未转输B细胞的实验组疾病状况严重,即使转输了Treg,症状也无法完全缓解；而共同转输了B细胞和Treg的实验组疾病症状较轻,且疾病后期有转归迹象。令人惊讶的是,未转输Treg而仅转输了B细胞的实验组疾病状况也较轻,因此,我们在疾病发生的急性期,用流式细胞仪技术分析了这组小鼠体内细胞的表达,结果显示,B细胞在肠炎微环境中有诱导幼稚型CD4+Foxp3-T细胞向CD4+Foxp3+Treg方向转化的作用。 大量文献表明,诱导型Treg (induced Treg, iTreg)和自然型Treg (nature Treg, iTreg)的表型和作用没有明显的区别。按照我们的假说,如果疾病最终由Treg缓解,那么我们只要转输大量的Treg就可以在B不存在的情况下缓解疾病。结果发现,大量转输Treg仍无法缓解疾病,说明Treg不是疾病的最终缓解因素。但是,Treg缺陷的情况下B细胞也不能发挥调节作用,这说明Treg和B细胞之间还存在着一种被我们忽视的关系。 如前所述,根据文献报道,肠粘膜的稳态由Treg和粘膜中的IgA等共同维持,因此我们检测了肠局部抗体的表达。结果发现,在疾病发生时IgA这一肠粘膜保护性免疫球蛋白有规律的增高,而IgM, IgG等免疫球蛋白的变化并不明显或无规律。更为重要的是,缺失Treg会使B细胞IgA的分泌显著的减少,疾病加重。 综上,我们认为,在DSS诱导的肠道炎症缓解中,B细胞首先诱导了幼稚型T细胞向Treg的极化,并促进了Treg增殖,从而维持了GALT中Treg的数量。其次,Treg正反馈性促进B细胞分泌大量的IgA,中和清除肠细菌,阻止了过度激活的免疫反应的发生,从而维持了肠稳态,对疾病起到了缓解作用。在本研究中,我们首次利用“MT小鼠建立了DSS诱导的炎症性肠病,并首次将Treg的作用与B细胞的调节作用以及其粘膜免疫功能的发挥结合在了一起。
【学位单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2013
【中图分类】：R574
【文章目录】：缩略词表
中文摘要
Abstract
前言
第一部分 B细胞负性调节DSS诱导的炎症性肠病的症状
材料与方法
结果
讨论
第二部分 Treg参与B细胞介导的炎症性肠病的抑制功能
材料与方法
结果
讨论
第三部分 B细胞与Treg在肠炎中的相互作用及机制
材料与方法
结果
讨论
小结
参考文献
综述
参考文献
个人基本情况
致谢
【共引文献】
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本文编号：
2840454
