研究背景和目的肝硬化门脉高压症是临床较多见的一类综合症,它的病因有很多种,但在我国大多数为肝炎后肝硬化,临床上可见多系统受累,代偿期症状较轻,晚期则以肝功能损害和门脉高压为主要表现,出现上消化道出血、肝性脑病、腹水、肝癌等严重并发症。肝静脉压力梯度(hepatic venous pressure gradient,HVPG)是指肝静脉楔压与自由压之差。正常HVPG是3-5mmHg,5mmHg定义为门脉高压。对于肝硬化门脉高压症的发病机制,目前有多种学说,如阻力学说即后向性血流学说,门脉高压高动力学说又称为前向性血流学说,液递学说等等。近期国内有研究者认为,内脏高动力循环、内脏血管病变、门静脉高压症彼此间互相影响,其中各种肝脏疾病引起门脉入肝血流受阻是造成门脉高压的起始因素,是后续各种病理改变的原因,这即为“门静脉高压性血管病变”学说。而有关ET-1和Ang Ⅱ在心血管系统中的作用实验比较成熟及热门,由于其不仅有强烈的缩血管作用,还能结合其特定受体而引起细胞收缩,促进细胞增殖,上调原癌基因和早期基因的表达,提示ET-1、Ang Ⅱ可促进血管外基质的合成,从而在血管构型的改建中发挥作用。我们推测两者可能在肝硬化门脉高压中亦可能发挥作用,但其作用机制如何呢?本研究通过收集患者的一些数据,测量血清ET-1和Ang-Ⅱ水平,收集的肝硬化患者中病因分类、并发症种类、肝功能Child-pugh分级、食管黏膜下静脉MDCT评分,胃镜下表现等,应用Logistic回归分析,研究收集的肝硬化患者中肝炎后肝硬化、合并腹水、肝功能Child-pugh分级、食管黏膜下静脉MDCT评分、血清ET-1、血清Ang-Ⅱ等因素是否与肝硬化患者HVPG升高有关;最后通过大鼠试验,观察内皮素1(ET-1)、血管紧张素Ⅱ(Ang-Ⅱ)及其他相关因子在肝硬化门脉高压阻断剂治疗前后的差异。第一部分:肝硬化患者肝静脉压力梯度(HVPG)与患者血清ET-1、Ang-Ⅱ的关系研究目的:分析肝硬化患者肝静脉压力梯度(HVPG)与患者血清ET-1、Ang-Ⅱ的关系。方法:收集2017年1月至2017年12月在我院消化内科住院治疗并行HVPG检测的120例肝硬化患者。根据HVPG值分为1 OmmHg组(HVPG值为10mmHg),≥1OmmHg组(HVPG值10mmHg)。比较两组患者的临床特征及血清ET-1、Ang-Ⅱ水平差异,对肝硬化患者HVPG的影响因素进行分析,分析HVPG与患者血清ET-1、Ang-Ⅱ的关系。结果:120例患者中,HVPG10mmHg者纳入47例,≥1OmmHg者纳入73例。≥10mmHg组肝炎后肝硬化、合并腹水、肝功能为B和C级、食管黏膜下静脉MDCT评分为2-3分的比例均明显高于10mmHg组,血清ET-1、Ang-Ⅱ水平明显高于10mmHg组(P0.05)。Logistic回归分析结果显示肝炎后肝硬化、合并腹水、肝功能Child-pugh分级、食管黏膜下静脉MDCT评分、血清ET-1、血清Ang-Ⅱ水平均是肝硬化患者HVPG升高的影响因素(P0.05)。结论:肝炎后肝硬化、合并腹水、肝功能Child-pugh分级、食管黏膜下静脉MDCT评分、血清ET-1、血清Ang-Ⅱ水平均是肝硬化患者HVPG升高的影响因素(P0.05)。第二部分:不同药物干预对肝硬化大鼠血清内皮素1及血管紧张素Ⅱ的影响目的:探讨不同药物干预对肝硬化大鼠肝脏组织学、血清内皮素1及血管紧张素Ⅱ表达的影响。方法:将60只健康Wister雄性大鼠,随机分为对照组(A组)、肝硬化门脉高压组(B组)、波生坦组(C组)、氯沙坦组(D组)、卡托普利组(E组),每组12只。A组作为健康对照未进行建模。B、C、D、E组采用CC14、苯巴比妥复合建立肝硬化门脉高压症大鼠模型;在成模期,B组未给予药物干预,C、D、E组依次给予波生坦(100mg/kg)、氯沙坦(100mg/kg)、卡托普利(100mg/kg)灌胃干预。对各组大鼠肝组织进行HE、Massion染色及门静脉压力测定;检测各组大鼠门静脉血清ET-1、Ang-Ⅱ水平,对各组门静脉进行HE、Massion染色,采用免疫组化检测门静脉NF-κB、TGF-β的表达,以原位杂交实验检测VEGF mRNA的表达,并用实时定量PCR(RT-PCR)法检测Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的相对表达情况。门脉测压的方法:大鼠开腹,显露门静脉主干后,以游标卡尺量测量主干外径,通过测压导管经大鼠肠系膜前静脉至门静脉主干,通过压力换能器及生理记录仪测量压力变化,脊柱前缘设置为0,间接测量门脉压力。结果:(1)肝硬化门静脉高压建模情况:①B、C、D、E组大多数动物在诱导过程中活动逐渐减少,精神不振,食欲欠佳,每天饮水20-25ml,反应迟钝,皮肤无光泽,有不同程度的腹水,体重减轻。存活大鼠数量:A组12只,B组8只,C组9只、D组8只、E组10只。HE染色发现,A组肝小叶结构完整,肝索排列整齐,肝细胞形态正常;模型组(B)、不同的药物干预组(C、D、E组)肝小叶结构紊乱形成假小叶,小叶间胆管增生,大量炎细胞侵润。Masson染色:A组汇管区无纤维组织增生,肝中央静脉周和肝血窦周偶见少量的网状纤维。模型组(B)、不同的药物干预组(C、D、E组)汇管区纤维组织广泛增生,大量炎细胞浸润,破坏了肝小叶正常结构,并将其分割成大小不一、圆形或类圆形的肝细胞团,形成假小叶和小结节性肝硬变,但肝细胞再生不明显。模型组(B)、不同的药物干预组(C、D、E组)门脉压力明显高于A组,C、D、E组门脉压力明显低于B组(P0.05)。②肉眼可见,模型组(B)、不同的药物干预组(C、D、E组))门静脉较A组明显增粗。HE、Massion染色:A组内膜较薄,中膜由几层排列疏松的环行平滑肌构成,外膜较厚,由结缔组织构成,常含有较多的纵行平滑肌束;模型组(B)、不同的药物干预组(C、D、E组)内膜呈弥漫性或局部增厚,含大量平滑肌细胞和胶原纤维;局部增生呈丘状向腔内突出,受损血管内皮表面有微小血栓形成;中膜平滑肌细胞增生、肥大,肌纤维增粗,致密,并有部分向内膜突出。(2)免疫组织化B、C、D、E组的NF-κB、TGF-β表达水平及强度均高于A组(P0.05);C、D、E组的NF-κB、TGF-β表达水平、强度和积分光密度均低于B组;E组NF-κB、TGF-β表达水平、强度和积分光密度均低于C、D组(P0.05)。(3)原位杂交结果A组正常门静脉有较少的VEGF mRNA表达,而肝硬化门脉高压症大鼠模型(B、C、D、E)的门静脉VEGFmRNA表达水平显著上调(P0.05);B、C、D、E组VEGFmRNA阳性表达的阳性细胞数和积分光密度均明显高于A组,C、D、E组均较B组降低;E组明显低于C、D组(P0.05)。(4)Rt-PCR结果:模型组(B)、不同的药物干预组(C、D、E组)门静脉的Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达均明显高于A组,C、D、E组门静脉的Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达均明显低于B组,E组门静脉的Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达均低于C组和D组(P0.05)。(5)各组血清ET-1、Ang-Ⅱ水平比较情况模型组(B)、不同的药物干预组(C、D、E组)门静脉血清ET-1、Ang-Ⅱ水平均明显高于A组,D、E组门静脉血清ET-1水平均明显低于B组、C组,C组、E组血清Ang-Ⅱ水平均明显低于B组和D组(P0.05)。(6)各组门静脉压力比较情况模型组(B)、不同的药物干预组(C、D、E组)门静脉压力水平均明显高于A组,C、D、E组门静脉压力明显低于B组(P0.05)。结论:本研究通过动物实验发现,肝硬化时血清ET-1、Ang-Ⅱ明显升高,且与血清及组织学肝纤维化程度相一致;而采用相应拮抗剂的药物干预,会缓解肝纤维化程度。从而提示,ET-1、Ang-Ⅱ参与肝硬化门脉高压症的发生和进展。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R575.2
【部分图文】：
肝硬化门脉高压大鼠模型
图３．１肝硬化门脉高压大鼠模型??４??Ｋ?ＡＭ??
图３．３肝硬化门脉高压大鼠模型肝脏组织??二、肝硬化门脉高压大鼠模型肝脏组织的病理改变：??ＨＥ染色发现，Ａ组肝小叶结构完整，肝索排列整齐，肝细胞形态正常（图３．６）。??模型组（Ｂ组）、不同药物干扰组（Ｃ、Ｄ、Ｅ组）肝小叶结构紊乱形成假小叶，小??叶间胆管增生，大量炎细胞侵润（图３．７）。??Ｍａｓｓｏｎ染色：Ａ组汇管区无纤维组织增生，肝中央静脉周和肝血窦周偶见少??量的网状纤维。模型组（Ｂ组）、不同药物干扰组（Ｃ、Ｄ、Ｅ组）汇管区纤维组织??广泛增生，大量炎细胞浸润，破坏了肝小叶正常结构，并将其分割成大小不一、??圆形或类圆形的肝细胞团，形成假小叶和小结节性肝硬变，但肝细胞再生不明显??（图?３＿８）??３５??
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