胞嘧啶脱氨酶APOBEC3G抗乙型肝炎病毒的实验研究

发布时间：2020-10-15 21:24

　　 APOBEC3G(载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G)是一种RNA/DNA编辑酶,具有胞苷脱氨酶活性,可使胞嘧啶(C)脱氨基变为尿嘧啶(U),从而诱导病毒基因组发生碱基突变,导致病毒整个复制周期终止,具有很强的抗逆转录病毒活性。研究证实：APOBEC3G能抑制vif缺陷人类免疫缺陷病毒(HIV)-1及乙型肝炎病毒(HBV)复制。然而,APOBEC3G抑制HBV复制的具体作用机制,APOBEC3G基因在人体细胞中的其它生物学功能及其作用机制尚不清楚。另外,正常情况下,由于肝细胞不表达APOBEC3G或表达量相对很低,因此在HBV感染过程中,不同临床转归类型的慢性HBV感染患者之间,外周血及肝细胞中APOBEC3G表达是否会存在差异,APOBEC3G是否在慢性HBV感染患者机体内发挥了抗HBV作用,目前也不清楚。基于上述研究背景,本研究首先构建表达APOBEC3G蛋白的重组真核表达载体,并将其转染入HepG2.2.15细胞中,在体外初步探讨APOBEC3G对HBV复制表达的影响,观察HepG2.2.15细胞在高表达APOBEC3G后,APOBEC3G对细胞生长迁移能力、细胞周期和凋亡现象等生物学行为的影响。接着,观察APOBEC3G基因在不同慢性HBV感染类型(慢性乙型肝炎、慢性乙型重型肝炎、肝炎肝硬化、HBV相关性肝癌)患者的外周血单个核细胞(PBMC)及肝组织中的表达水平及其细胞内定位。最后,通过体内外实验探讨Janus激酶-信号传导和转录激活子(JAK-STAT)信号传导系统是否参与了APOBEC3G基因的转录调节,以及慢性乙型肝炎(CHB)患者发生干扰素抵抗的分子机制。 (1)APOBEC3G基因对HepG2.2.15细胞生物学行为的影响：应用RT-PCR法从人PBMC中扩增APOBEC3G基因,分子克隆法构建表达APOBEC3G蛋白的真核表达载体pcDNA3.1-APOBEC3G,并应用脂质体法将pcDNA3.1-APOBEC3G转染入HepG2.2.15细胞中,Western-blot鉴定细胞中APOBEC3G蛋白的表达。ELISA法检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg水平,实时定量PCR检测HBV DNA和HBV mRNA水平。应用有限稀释法筛选出高表达APOBEC3G的HepG2.2.15细胞,并通过Western-blot鉴定。应用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡；应用MTT法检测细胞株生长能力；应用划痕法观察细胞迁徙运动能力。结果显示：酶切鉴定证实APOBEC3G真核表达载体被成功构建,Western-blot证实APOBEC3 G蛋白可在HepG2 2.2.15细胞中表达。转染APOBEC3G重组质粒的HepG2.2.15细胞的HBsAg.HBeAg.HBV DNA及HBV mRNA水平均明显低于未转染重组质粒的HepG2.2.15细胞。pcDNA3.1-APOBEC3G转染的HepG2.2.15细胞、空载体pcDNA3.1转染的HepG2.2.15细胞与未转染质粒的HepG2.2.15细胞(空白对照)比较,细胞周期无明显变化[各期细胞所占比例分别为：G0/G1:(64.27±1.26)%vs(64.18±1.24) %vs (64.09±1.30)5,P0.05;S:(23.16±1.38)%vs (22.67±1.41)%vs (23.27±1.43)%,P0.05；G2/M:(11.36±1.26)%vs (11.84±1.31)%vs (11.37±1.22)%,P0.05],未见细胞凋亡现象,细胞的生长增殖无明显变化,细胞迁徙运动能力无明显变化[24h及48h细胞迁移抑制率分别为：(7.5±3.7)%vs (10.2±5.5)%,P0.05;(13.4±6.5)%vs (17.8±9.2)%,P0.05].实验结果证实：APOBEC3G明显抑制了HepG2.2.15细胞中HBV的复制与表达,高表达APOBEC3G对HepG2.2.15细胞生物学行为无明显影响。成功构建APOBEC3G真核表达载体为深入研究APOBEC3G抗HBV的作用机制奠定实验基础。 (2)APOBEC3G基因在不同慢性HBV感染类型患者中的表达及其细胞内定位：用Western blot及激光扫描共聚焦显微镜,以健康人为对照,检测不同慢性HBV感染类型患者(慢性乙型肝炎、慢性乙型重型肝炎、肝炎肝硬化、HBV相关性肝癌)的PBMC及肝组织中APOBEC3G的表达状况及其亚细胞定位。结果发现：健康人PBMC中APOBEC3G表达水平极低,慢性乙型肝炎、慢性乙型重型肝炎、肝炎肝硬化和HBV相关性肝癌患者PBMC中APOBEC3G蛋白相对表达水平倍数分别为4.12±0.21、4.07±0.28、4.16±0.36、4.21±0.39,均高于健康人。但不同慢性HBV感染类型患者之间两两比较,PBMC中APOBEC3G的表达水平差异无统计学意义(Q值分别为0.931、0.744、1.675、1.675、2.606、0.931,P值均0.05)。慢性乙型肝炎患者与HBV相关性肝癌患者比较,肝组织中APOBEC3G表达水平差异无统计学意义(4.40±0.34与4.34±0.43,Q=0.588,P0.05)。激光扫描共聚焦显微镜观察显示PBMC中或肝组织中APOBEC3G表达定位于胞质中,胞核中无表达。实验结果提示：慢性HBV感染患者虽有APOBEC3G的表达升高,可能只是HBV慢性感染的伴随表现,APOBEC3G是否参与机体抵御HBV感染的过程尚不清楚。 (3)干扰素-α在体内外诱导APOBEC3G及STAT-1的表达及其机制：应用不同浓度的干扰素(IFN)-a刺激HepG2.2.15细胞,接着应用RT-PCR及Western-blot检测细胞中APOBEC3G及STAT-1的表达水平变化。另外,选取对IFN-α抗病毒治疗完全应答的CHB患者5例(A组)、无应答患者8例(B组),应用RT-PCR及Western-blot检测观察两组患者肝组织中APOBEC3G及STAT-1的表达水平差异。结果发现：IFN-α明显抑制了HepG2.2.15细胞中HBV的复制与表达,同时增强了HepG2.2.15细胞中APOBEC3G基因的表达,并在一定范围内呈现剂量、时间依赖关系。而且,观察到STAT-1的表达也相应地逐渐升高。对IFN-α抗病毒治疗完全应答的CHB患者肝组织中STAT-1及APOBEC3G的表达水平明显高于对IFN-α抗病毒治疗无应答的CHB患者。实验结果提示：诱导细胞内APOBEC3G的表达可能是IFN-α抑制HBV的抗病毒机制之一,并且IFN-α可能通过JAK-STAT信号通道诱导APOBEC3G的表达。而且,对IFN-α抗病毒治疗无应答的CHB患者产生干扰素抵抗的机制可能与STAT-1的表达下调有关。
【学位单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2011
【中图分类】：R512.62
【部分图文】：

peDNA3.l一ApoBEC3G的质粒图谱

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图3APOBEC3G蛋白表达的W七stern一bI0t鉴定l:转染peDNA3.1一ApOBEC3G的HepG2.2.15细胞;2:转染空pG2.2.15细胞;3:未转染的HepG2.2.15细胞。l热2345678POB思C3C嚎黔鳄骊蘸祥蘸啼赢卜‘{嘿鬓嘿矍纂巍蕊:麟撰黝图4高表达1一6:转染APOBEC3G单克隆细胞株的W七stern一blot鉴定PeDNA3.l一APOBEC3G7:转染空载体的HePG2.2.巧细胞;的HepG2.2.15细胞;8:未转染的HePG2.2.巧细胞。
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 ;肝衰竭诊疗指南[J];中华肝脏病杂志;2006年09期

本文编号：2842262