不同浓度嗜酸乳酸杆菌对急性实验性结肠炎的疗效和结肠菌群的影响及其免疫相关机制研究

发布时间：2020-10-19 23:02

　　 目的：筛选能有效治疗实验性结肠炎的适宜的嗜酸乳酸杆菌浓度,并对其进行治疗结肠炎的疗效评价。 方法：采用2.5%DSS诱导小鼠结肠炎模型,70只Balb/c小鼠随机分为7组：模型组、阴性对照组(菌粉保护剂组)、阳性对照组(美沙拉嗪组)、嗜酸乳杆菌低剂量组(1×106CFU/mL)、中剂量组(1×107CFU/mL)、高剂量组(1×108CFU/mL)、正常组。实验期间每日观察小鼠进食、饮水、活动等一般情况,称量体重,观察粪便性状及粪便隐血、便血情况,计算DAI积分,评估结肠炎严重程度。实验第7天,乙醚麻醉状态下处死小鼠,解剖腹腔,观察结肠的大体改变、测量长度。剪取距肛门2 cm左右病变的结肠段,纵向剖开冰生理盐水冲洗干净后,一部分结肠组织经中性甲醛溶液固定后,石蜡包埋切片行HE染色,其余结肠组织液氮保存以备它用。 结果：模型组小鼠DAI积分及组织病理学积分要明显高于正常组(7.81±1.02 VS 0,5.80±2.94 VS 0,P0.05),嗜酸乳杆菌低中高剂量组和美沙拉嗪干预后,小鼠DAI积分及组织病理学积分较模型组有明显下降(6.20±2.64,5.00±1.21,5.72±2.63,5.81±1.32VS7.81±1.02：4.25±2.05,2.56±1.81,2.20±1.12,3.10±2.60VS 5.80±2.94,P0.05)。 结论：嗜酸乳杆菌可明显改善小鼠结肠组织损伤,其中以高浓度级嗜酸乳酸杆菌干预组(1×108 CFU/mL)小鼠结肠炎症状缓解最明显。 目的：针对肠道菌群生物群落结构复杂,采用PCR-SSCP的方法获得肠道菌群图谱,平板培养计数的方法获得常见菌群的变化。比较模型组和正常组小鼠的肠道菌群的图谱变化,分析小鼠肠道微生物多样性的总体变化和可培养细菌菌群的变化,为肠道菌群结构解析提供有效手段。 方法：运用平板计数和基于细菌16sRNA的PCR-SSCP技术分析。20只Balb/c小鼠随机分为2组,正常组和模型组各10只,模型组每天给与2.5%DSS自由饮用,造成急性溃疡性结肠炎模型,在第7天乙醚麻醉状态下处死小鼠,分离结肠,提取细菌组DNA进行PCR-SSCP分析,针对优势条带回收克隆测序,初步确定肠道中差异明显的微生物细菌种类。并留取部分远端结肠进行菌群定植数量分析。 结果：实验性结肠炎小鼠与正常小鼠相比,肠道菌群中肠球菌和肠杆菌数量增多,乳酸杆菌和双歧杆菌数量明显减少。两组研究对象的肠道菌丛存在整体差异。SSCP指纹图谱分析显示,实验性结肠炎小鼠细菌微生物区系的多样性明显减少。正常组10个样本主带分布非常一致,均出现在约0.6-0.7 kb处,而模型组主带位置无统一趋势。测序结果表明模型组与正常小鼠菌群比较主要是不可培养细菌的差异。给予嗜酸乳杆菌干预后可以调节远端结肠中肠道菌群的组成,双歧杆菌和乳酸杆菌的数量增加,金黄色葡萄球菌数目减少,总需氧菌、拟杆菌无明显变化。其中以嗜酸乳杆菌1×108CFU/ml浓度级组肠道菌群变化最明显,干预效果最佳。 结论：实验性结肠炎小鼠肠道菌群分析提示存在菌群失调,乳酸杆菌和双歧杆菌数量减少,金黄色葡萄球菌和总需氧菌明显增多。肠道菌群多样性减少,肠道优势菌群种类少,细菌种群发生变化,与正常小鼠相比较主要是不可培养细菌的差异。平板培养结果表明,给予不同浓度嗜酸乳杆菌干预后,可以调节肠道菌群的组成,总乳酸杆菌和双歧杆菌数目增加,金黄色葡萄球菌数目明显减少,总需氧菌数目无明显变化；其中以嗜酸乳杆菌1×108CFU/ml浓度级组有疗效最佳。 目的：探讨不同浓度的嗜酸乳酸杆菌对实验性结肠炎模型鼠起治疗作用的免疫学机制。研究嗜酸性乳酸杆菌对与IBD发病密切相关的Th1/Th2免疫轴相关IL-12/STAT4/T-bet.IFN-γ/STAT1／T-bet、IL-4/GATA3信号途径中的主要相关细胞因子和信号因子的影响,为进一步探索嗜酸乳酸杆菌治疗实验性结肠炎机制以及用量提供帮助。 方法：实验动物、分组、模型建立及给药方案与第一章相同,在实验结束时处死动物留取各组结肠标本,RT-PCR方法检测小鼠结肠黏膜中细胞因子IL-12、IL-4、IFN-γ及信号因子T-bet、STAT1、STAT4和GATA3的表达,western blotting和免疫组化检测T-bet在结肠组织的表达量及表达部位。 结果：嗜酸乳杆菌低中高剂量组及美沙拉嗪干预后在细胞因子水平,嗜酸乳杆菌可明显降低IFN-γ、IL-12的表达(0.79±0.21,0.68±0.01,0.62±0.09,0.77±0.12 VS 0.76±0.03,P0.05；0.36±0.02,0.37±0.04,0.35±0.13,0.35±0.05 VS0.52±0.02,P0.05),增加IL-4(0.78±0.11,0.75±0.03,0.82±0.06,0.81±0.12 VS 0.60±0.04,P0.05)的表达。其中又以嗜酸乳杆菌高剂量组效果最佳(0.62±0.09 VS 0.76±0.03:0.35±0.13 VS0.52±0.02,P0.05：0.82±0.06 VS0.60±0.04,P0.05)。 嗜酸乳杆菌低中高剂量组及美沙拉嗪干预后在核酸水平转录因子STAT1、T-bet、STAT4的表达较模型组降低(0.59±0.05,0.55±0.04,0.54±0.06,0.45±0.04 VS0.76±0.05；0.28±0.12,0.27±0.03, 0.23±0.04VS0.41±0.01,P0.05；0.36±0.02VS0.41±0.01,P0.05；0.80±0.03,0.77±0.02,0.72±0.15,0.76±0.14 VS0.94±0.21,P0.05), GATA3的表达升高(0.78±0.25, 0.75±0.23, 0.82±0.16,0.81±0.09 VS 0.60±0.23,P0.05),但仍低于正常组(VSO.88±0.19,P0.05)。而T-bet的蛋白表达水平和免疫组织化学表达都与mRNA表达水平有相同的趋势,较模型组降低(0.27±0.04,0.23±0.02,0.18±0.04,0.27±0.11VS0.30±0.04；0.263±0.045,0.234±0.015,0.114±0.025,0.252±0.024 VS 0.322±0.064,P0.05)。其中又以嗜酸乳杆菌高剂量组干预效果最佳(0.18±0.04VS0.30±0.04,0.114±0.025 VS 0.322±0.064,P0.05). 结论：嗜酸乳酸杆菌能有效改善实验性结肠炎的黏膜炎症,其部分作用机制可能是通过抑制IFN-γ／STAT1、IL-12/STAT4信号途径,相对激活IL-4/GATA3信号途径,从而达到对实验性结肠炎的治疗作用。
【学位单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2010
【中图分类】：R574.62
【部分图文】：

菌和美沙拉嗦治疗后，小鼠体质量下降变缓，腹泻和粪便隐血情况好转。在第7天各干预组体质量下降要明显低于模型组(尸<0.05)，嗜酸乳杆菌高剂量组对体质量减轻的保护强于中低剂量组和美沙拉嗦(尸>0.05，图1一1)。~~~人棋型组 组~~~B阴性对照 照 CCC阳性对照组 组一 一DIO6组 组一一E107组 组~~~F108组 组一一G正常组 组牟粼叫牲滋冷承图1一 1UC急性期各组小鼠体质量变化(相对于实验第1天，体重增加为正值，体重减轻为负值)o1.2小鼠结肠大体情况及结肠长度的变化处死小鼠解剖腹腔，见正常小鼠结肠颜色呈淡红色，肠腔内粪便成形，纵行剖开观察可见勃膜完整光滑，无糜烂和溃疡。模型组和阴性对照组小鼠结肠肠壁变薄，结肠长度明显缩短，肠腔内可见不成形便，部分小鼠肠腔内有暗红色血便;纵行剖开观察可见勃膜弥漫性的充血肿胀，表面糜烂，部分可见浅表溃疡形成。其余各组结肠缩短有所缓解，肠腔内出血少见，粪便基本成形;纵行剖开观察可见勃膜充血肿胀减轻，较模型组及阴性对照组明显好转。分离从盲肠至肛门的全段结肠

菌和美沙拉嗦治疗后，小鼠体质量下降变缓，腹泻和粪便隐血情况好转。在第7天各干预组体质量下降要明显低于模型组(尸<0.05)，嗜酸乳杆菌高剂量组对体质量减轻的保护强于中低剂量组和美沙拉嗦(尸>0.05，图1一1)。~~~人棋型组 组~~~B阴性对照 照 CCC阳性对照组 组一 一DIO6组 组一一E107组 组~~~F108组 组一一G正常组 组牟粼叫牲滋冷承图1一 1UC急性期各组小鼠体质量变化(相对于实验第1天，体重增加为正值，体重减轻为负值)o1.2小鼠结肠大体情况及结肠长度的变化处死小鼠解剖腹腔，见正常小鼠结肠颜色呈淡红色，肠腔内粪便成形，纵行剖开观察可见勃膜完整光滑，无糜烂和溃疡。模型组和阴性对照组小鼠结肠肠壁变薄，结肠长度明显缩短，肠腔内可见不成形便，部分小鼠肠腔内有暗红色血便;纵行剖开观察可见勃膜弥漫性的充血肿胀，表面糜烂，部分可见浅表溃疡形成。其余各组结肠缩短有所缓解，肠腔内出血少见，粪便基本成形;纵行剖开观察可见勃膜充血肿胀减轻，较模型组及阴性对照组明显好转。分离从盲肠至肛门的全段结肠

乳杆菌高中低剂量组DAI评分分别为5.72、5.00、6.20分，明显低于模型组伊 <0.05)，而各干预组小鼠DAI积分水平相当(P习.05)，无明显差异。其中又以嗜酸乳杆菌中剂量组DAI积分降低最明显(图1一)。
【引证文献】

相关期刊论文 前1条

1 刘玉婷;郝微微;历娜娜;温红珠;曹丽静;李佳;;溃疡性结肠炎与肠道菌群的研究进展[J];世界华人消化杂志;2013年27期

相关博士学位论文 前1条

1 胡胜兰;匹多莫德对巨噬细胞极化及其功能的影响[D];浙江大学;2014年

本文编号：2847829