乙肝病毒X蛋白对肝细胞凋亡的影响新型抗乙肝病毒化合物的筛选

发布时间：2020-10-21 01:38

　　 乙肝病毒X蛋白对肝细胞凋亡的影响新型抗乙肝病毒化合物的筛选 乙肝病毒X蛋白(HBV X protein, HBx)与乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)相关肝癌(HCC)的发生和发展密切相关。深入研究HBx在HCC形成中的作用将为探索HBV致癌机制提供重要依据。HBx为多功能蛋白,能够调节细胞内多条信号传导途径,从而调控许多细胞基因的转录；HBx还可以调节细胞增殖与凋亡,促进肝癌细胞的侵袭和转移。 许多文献表明HBx既具有促进细胞凋亡又具有抑制细胞凋亡的功能,原因还不清楚。在本研究中,我们发现HBx对Huh7肝细胞凋亡的影响存在剂量依赖性,在低剂量转染HBx表达质粒时,HBx抑制细胞凋亡,而当HBx表达质粒的转染量达到较高水平时,HBx反而会促进细胞凋亡。近期Clippinger等发现在同一细胞株中HBx即可以促进细胞凋亡又可以抑制细胞凋亡,决定因素在于NF-kB的活性状态。我们的研究初步发现HBx随着表达量的不同可以影响NF-κB的细胞定位。 全球约有3亿5千万人被HBV慢性感染,其中10-15%的慢性肝炎忠者最终可能发展为肝硬化或肝细胞癌。目前慢性乙肝的治疗药物主要有两大类,核苷(酸)类似物和干扰素。现有药物存在的主要问题是核苷(酸)类似物长期使用会诱导病毒耐药株的出现；而干扰素应答率低且副作用大,因此迫切需要研发新型抗HBV药物。 金丝桃(Hypericum chinense L.)是金丝桃科金丝桃属植物。文献研究曾发现金丝桃具有抗菌抗病毒的活性。本部分中,我们与复旦大学药学院穆青课题组合作,在细胞水平上对金丝桃的各种分离提取物进行了细胞毒性分析和抗HBV活性分析,初步筛选出了单体HCF2-4-2-5,其对HBV DNA复制、HBsAg和HBeAg蛋白的表达水平均有一定的抑制作用,为进一步研究提供了先导化合物。 第一部分HBx蛋白对Huh7肝细胞凋亡的影响 目的验证HBx蛋白的不同表达剂量对Huh7肝细胞的凋亡是否存在不同的影响。 方法构建HBx表达质粒,通过脂质体转染的方法将不同量的HBx表达质粒分别转染入Huh7肝细胞和293T细胞中,转染48h后进行凋亡相关的检测,包括FITC-Annexin V流式细胞检测,Caspase 3蛋白酶的降解体的检测,线粒体及胞浆内Cytochrome C的检测等,以确定细胞凋亡的变化情况与HBx的表达量是否存在规律性的关联。通过免疫荧光共聚焦方法对HBx和NF-kB的细胞内定位进行了初步探索。 结果HBx的不同表达量可对细胞凋亡产生不同的影响。对于1×106个细胞,在转染较低量的HBx表达质粒(0.25μg、0.5μg)时,可以一定程度的抑制凋亡作用；而当HBx表达质粒的转染量提高到1μg以上时,细胞凋亡反而愈发明显。进一步研究发现不同量的HBx在细胞内的定位不同,而NF-kB随之在细胞内的定位也不同,为研究不同剂量HBx对细胞凋亡的影响机制提供了初步的线索。 结论HBx在低表达量时可以抑制细胞凋亡,而高表达量时反而促进细胞凋亡。 第二部分新型抗HBV化合物的筛选 目的从金丝桃植物中提取分离一系列粗产物及化合物单体进行抗HBV活性的筛选,以期获得具有抗HBV活性的先导化合物。 方法培养HBV稳定复制的肝癌细胞(HepG2.2.15),将不同稀释度的化合物分别加入培养基中,4天后通过CCK-8法检测药物的细胞毒性,确定合适(存活率90%以上)的用药浓度。抗病毒活性筛选中,加药4天后分别用ELISA法检测细胞培养基中HBsAg、HBeAg表达量及应用Real-time PCR法检测上清中及胞内HBV DNA的含量。 结果从金丝桃中提取的单体化合物HCF2-4-2-5可明显减少HepG2.2.15细胞上清中的HBV DNA含量。 结论HCF2-4-2-5具有一定的抗HBV活性,为在此基础上进一步优化奠定了基础。
【学位单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2011
【中图分类】：R512.62;R735.7
【文章目录】：
摘要
Abstract
前言
第一部分 HBx调节Huh7细胞凋亡作用的研究
    引言
    材料与方法
    结果
    讨论
第二部分 新型抗HBV化合物的筛选
    引言
    材料与方法
    结果
    讨论
参考文献
致谢

【参考文献】

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1 项光亚,周宜开;化学发光法检测金丝桃对DNA损伤的保护作用[J];同济医科大学学报;2000年03期

2 项光亚,杨瑜,阮金兰,周宜开;金丝桃化学成分研究[J];同济医科大学学报;2001年05期

本文编号：2849444