转录因子Nrf2在小鼠酒精暴露引发的肝脏及胰腺损伤中的作用及其机制研究

发布时间：2020-10-26 11:51

　　 目的:酒精(Ethanol,EtOH)是一种使人产生依赖性的物质,适量饮用可以缓解焦虑,给人以欣快感,长期以来在世界各地广泛应用。近些年随着我国经济和生活水平的提高,狂饮和酗酒者比例明显增加,中国已经成为全球重度饮酒国家之一。因此,过度饮酒导致的负面效应以及引发的疾病是一个亟待解决的重要公共卫生问题。人体短时间摄入大量EtOH及含EtOH饮料,可导致一系列临床综合征,其涉及机体多器官、多系统损伤,尤其累及消化系统。肝脏为急性酒精损伤的主要器官,而另一主要靶器官则为胰腺。氧化应激在EtOH相关性疾病中的作用被广泛认可。转录因子NF-E2相关因子2(Nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2)是调控抗氧化防御基因及Ⅱ相解毒酶的核心转录因子,对细胞内适应性抗氧化反应和氧化还原稳态调控具有重要作用。既往研究表明,Nrf2全身敲除(Nrf2-knockout,Nrf2-KO)可致酒精饲料暴露下实验小鼠死亡率增加,但其具体机制尚不清楚。然而,Nrf2与酒精性胰腺损伤的研究尚处空白。富马酸二甲酯(Dimethyl fumarate,DMF)是迄今为止唯一获准列入临床一线用药的Nrf2激动剂,主要用于多发性硬化症的治疗。目前尚未用于任何EtOH相关性疾病的治疗。因此,DMF对EtOH相关疾病的干预作用及其机制有待证实和探讨。据此,本研究第一部分利用Nrf2-KO小鼠与原代肝细胞的体内外相结合,探讨Nrf2在急性酒精中毒(Acute alcohol intoxication,AAI)表现中的作用并进行机制解析。随后,给予Nrf2激动剂DMF,观察其对AAI是否具有保护作用。长期酗酒可形成酒精性肝病(Alcoholic liver disease ALD),酒精性脂肪肝(Alcoholic fatty liver disease,AFLD)是ALD早期病理学改变,并逐渐进展为酒精性肝炎、纤维化、肝硬化,甚至终末形成肝癌,ALD是构成EtOH慢性损伤的基础病变。AFLD这一病理阶段可通过药物干预或者戒酒而有效逆转,是临床上治疗ALD的最佳时期。因此,积极探讨AFLD这一病理阶段的发病机制和干预策略意义重大。研究表明,Nrf2可以通过调节脂代谢及炎症反应减轻ALD。利用Nrf2-KO小鼠模型探索Nrf2与ALD发病虽取得一定进展,但也存在自身局限性。机体维持自身脂代谢稳态涉及多器官、多系统的协同作用,Nrf2全身敲除不能阐明参与调控脂代谢可塑性诸多组织器官中,究竟哪一器官和环节内Nrf2发挥至关重要的作用。肝脏作为EtOH氧化和脂肪代谢的主要场所,肝脏中肝细胞和枯否细胞在执行生理功能、ALD发病中发挥着重要的作用。我们假设肝细胞和枯否细胞内Nrf2可能在ALD发病中起到关键作用。因此,运用Nrf2肝细胞特异性敲除(Hepatocyte specific Nrf2-knock out,Nrf2-(L)KO)和Nrf2髓系细胞特异性敲除(Myeloid cell specific knockout,Nrf2-(M)KO)小鼠模型探讨Nrf2与ALD的发病关系寻找更为准确、有效的治疗靶点势必具备更加明显优势。因此,本研究第二和第三部分运用Nrf2-(L)KO和Nrf2-(M)KO小鼠以Lieber-DeCarli酒精液体饲料造模方式,观察肝细胞和髓系细胞内Nrf2缺失在ALD发病中的作用及其机制。通过以上三部分研究相结合,旨在全方位、多角度解析Nrf2在EtOH暴露所致肝脏及胰腺损伤中的作用,为AAI及ALD的临床治疗提供新的理论依据。研究方法:1.Nrf2-KO小鼠急性EtOH暴露与DMF干预实验雌性8-12周的Nrf2全身敲除(Nrf2-knock out,Nrf2-KO)小鼠及同窝出生的野生型(Wild type,WT)小鼠,每组5-8只。以一次经口灌胃的方式给予50%的EtOH(6.0 g/kg BW),随后连续监测小鼠血糖和核心体温,记录其死亡时间,绘制生存曲线。为获得足够样本量,进行机制分析,另取雌性8-12周的Nrf2-KO小鼠及同窝出生Nrf2-WT小鼠,随机分为Nrf2-WT对照(Vehicle,Veh)组,Nrf2-KO Veh组和Nrf2-WT EtOH组,Nrf2-KO EtOH组,每组5-8只。以一次性经口灌胃方式给予50%的EtOH(4.8 g/kg BW)连续两次,两次灌胃时间间隔12 h,对照组给予等体积的蒸馏水,灌胃后密切监测小鼠血糖和核心体温,并于第二次EtOH灌胃12 h后收集标本,检测小鼠肝功能、胰腺功能、EtOH代谢相关酶类表达及活力,内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)相关蛋白及Nrf2下游基因表达情况。为进一步探究Nrf2缺失对EtOH代谢能力及ERS的影响,本研究提取Nrf2-(L)KO小及同窝出生的(Nrf2-knock in,Nrf2-KI)小鼠的肝细胞进行原代培养,分别以200mmol/L EtOH和1μg/ml的衣霉素(Tunicamycin,TUN)分别处理原代肝细胞,并于0,2,6,12,18和24 h后收集各组细胞,检测参与ERS相关蛋白及基因、EtOH代谢相关基因表达水平。最后利用野生小鼠分为Veh组和DMF干预组,每组8只。以经口灌胃的方式给予25 mg/kg的DMF或等体积的羧甲基纤维素(Carboxymethyl cellulose,CMC),每天两次,连续五天。之后禁食4小时,以经口灌胃的方式给予50%的EtOH(6.0 g/kg体重)两次,两次灌胃时间间隔12小时,并于第二次EtOH灌胃前3小时以经口灌胃的方式给予DMF及等体积的CMC。EtOH暴露后,密切监测实验动物生命体征,评估存活率。2.Nrf2-(L)KO小鼠Lieber-DeCarli酒精液体喂养实验将雄性12-16周Nrf2-(L)KO小鼠及同窝出生的和Nrf2-KI小鼠,喂饲6.3%的酒精液体饲料,观察其体重及死亡情况,绘制生存曲线。另取雄性12-16周的Nrf2-(L)KO小鼠及同窝出生的Nrf2-KI小鼠分为四组:Nrf2-KI对照(Control,Cont)组,Nrf2-KI EtOH组,Nrf2-(L)KO Cont组,Nrf2-(L)KO EtOH组。每组6-8只。喂饲4.2%的酒精液体饲料28,42天,检测小鼠肝功能水平,损伤相关蛋白表达及转录水平。3.Nrf2-(M)KO小鼠Lieber-DeCarli酒精液体饲料暴露实验将雄性12-16周Nrf2-(M)KO及同窝出生的Nrf2-KI小鼠分为4组:Nrf2-KI Cont组,Nrf2-(M)KO Cont组,Nrf2-KI EtOH组和Nrf2-(M)KO EtOH组。每组6只。喂饲4.2%的酒精液体饲料42天,检测小鼠肝功能水平,EtOH代谢相关酶类表达及活力和参与炎症反应、纤维化及脂代谢相关蛋白和基因表达水平。.结果:1.全身Nrf2缺失使小鼠急性EtOH暴露死亡率增加,血糖和核心体温下降6.0 g/kg BW EtOH灌胃后,Nrf2-KO小鼠血糖和体温水平始终低于Nrf2-WT小鼠,比较其曲线下面积,差异均具有统计学意义(p0.05)。观察至小鼠状态稳定,Nrf2-KO小鼠死亡率达70%,而Nrf2-WT小鼠未见死亡。以4.8 g/kg BW EtOH连续两次灌胃小鼠,与Nrf2-WT小鼠相比,Nrf2-KO小鼠于EtOH暴露24 h后,核心体温水平显著低于Nrf2-WT小鼠(p0.05)。并且,Nrf2-KO小鼠血糖水平曲线较Nrf2-WT小鼠整体下移,于EtOH暴露后12 h和24 h差异具有统计学意义(p0.05)。2.Nrf2缺失对小鼠EtOH代谢能力的影响体内实验结果表明:小鼠肝脏内Cyp2e1,Cat,Adh和Aldh2 mRNA的相对表达在基础水平两基因型小鼠间无差异;而Nrf2-KO小鼠中Aldh1a1 mRNA水平明显低于Nrf2-WT小鼠(p0.05)。ADH活力在对照组和EtOH组,两基因型间无差异,而EtOH处理后,Nrf2-KO小鼠ALDH活力降低(p0.05),并且显著低于EtOH暴露后的Nrf2-WT小鼠水平(p0.05)。体外实验表明,Nrf2-(L)KO小鼠原代肝细胞Cat,Aldh1a1和Aldh2 mRNA的相对表达量在基础水平明显低于Nrf2-KI小鼠原代肝细胞(p0.05)。EtOH处理后Cyp2e1,Cat,Adh,Aldh2均被诱导(p0.05),并且,Nrf2-(L)KO小鼠肝细胞的上述基因相对表达量明显低于Nrf2-KI小鼠肝细胞(p0.05)。EtOH处理使小鼠乙醛代谢的基因Aldh1a1 mRNA的相对表达显著下降(p0.05),其中,Nrf2-(L)KO小鼠肝细胞中Aldh1a1 mRNA水平明显低于Nrf2-KI小鼠,差异有统计学意义(p0.05)。3.全身Nrf2缺失加重小鼠酒精性肝损伤EtOH暴露后Nrf2-KO小鼠与Nrf2-WT小鼠相比,谷丙转氨酶(Alanine transaminase,ALT)和谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)曲线均上移,Nrf2-KO小鼠的ALT曲线下面积大于Nrf2-WT小鼠(p=0.06),与Nrf2-WT小鼠相比,Nrf2-KO小鼠的AST曲线下面积亦呈升高趋势(p=0.07)。EtOH暴露后小鼠肝脏BIP表达明显增加,与EtOH处理后的Nrf2-WT小鼠相比,其表达量明显下降(p0.05),而CHOP各组间未见明显差异。进一步提取原代肝细胞发现,EtOH和TUN处理后,Nrf2-(L)KO组细胞BIP蛋白表达水平低于Nrf2-KI组细胞。4.全身Nrf2缺失加重小鼠酒精性胰腺损伤HE染色显示EtOH暴露后小鼠胰腺损伤加重,与Nrf2-WT小鼠相比,Nrf2-KO小鼠出现明显胰腺实质坏死,免疫组化呈现内外分泌部Cleaved-Caspase 3表达增加及胰岛素外溢于外分泌部。EtOH暴露显著增加小鼠淀粉酶(Amylase,AMS)活性(p0.05),但两基因型间无差异。EtOH组Nrf2-KO小鼠脂肪酶(Lipase,LPS)水平较Veh组显著升高(p0.05),且明显高于EtOH处理后Nrf2-WT小鼠(p0.05)。EtOH处理使小鼠血浆中胰岛素水平显著增加(p0.05),且与EtOH处理后Nrf2-WT小鼠相比,Nrf2-KO小鼠血浆胰岛素水平显著升高(p0.05)。5.DMF显著缓解小鼠急性EtOH暴露引发的致死效应DMF处理组肝脏的Nrf2的下游基因Gclc和Nqo1 mRNA水平均高于Veh组,且Gclc和Nqo1 mRNA表达量差异具有统计学意义(p0.05)。与Veh组相比,DMF组小鼠的血糖水平在EtOH灌胃后的各监测点均显著高于Veh组小鼠(p0.05)。整个实验期间,DMF组小鼠体温高于Veh组,并于EtOH灌胃后24 h差异具有统计学意义(p0.05)。实验结束,86%的DMF组的小鼠存活,而VeH组接近40%小鼠死亡。6.肝细胞内Nrf2缺失对小鼠Lieber-DeCarli酒精液体饲料暴露后一般情况的影响肝细胞内Nrf2缺失使小鼠EtOH暴露后死亡提前、死亡率增加。酒精液体饲料造模期间,各组小鼠摄食量、体重和脏器系数的差异无统计学意义(p0.05)。液体饲料造模1周和6周后,各组小鼠体脂含量差异无统计学意义(p0.05)。液体酒精饲料造模中期,EtOH组小鼠空腹血糖水平显著高于Cont组小鼠(p0.05),但两基因型间的差异无统计学意义(p0.05)。GTT的结果显示,注射葡萄糖后各个时间点,各组小鼠的血糖水平均无显著差异(p0.05),计算其曲线下面积,EtOH组Nrf2-KI小鼠曲线下面积明显大于Cont组Nrf2-KI小鼠(p0.05)。7.肝细胞内Nrf2缺失对Lieber-DeCarli酒精液体饲料暴露后小鼠肝脏病理及肝功能的影响4.2%液体饲料喂饲28天,小鼠均出现较轻度肝脏损伤,但两基因型间未见明显差异。各组小鼠ALT、AST和丙二醛(Malonyldialdehyde,MDA)水平,差异均无统计学意义(p0.05)。酒精液体饲料造模42天,小鼠出现程度相等的中重度肝脏损伤,ALT,AST和甘油三酯(Triglyceride,TG)结果显示,两基因型间亦未见明显差异(p0.05)。8.肝细胞内Nrf2缺失对Lieber-DeCarli酒精液体饲料暴露后小鼠肝脏组织炎症、纤维化相关基因表达的影响4.2%酒精液体饲料喂饲42天,各组小鼠肝脏组织炎症相关基因IL-6、IL-1β和F4/80,纤维化相关基因α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Collagen和Fibronectin mRNA表达的差异无统计学意义(p0.05)。9.肝细胞内Nrf2缺失对Lieber-DeCarli酒精液体饲料暴露后小鼠肝脏组织脂质代谢相关表达的影响4.2%液体饲料喂饲28天,各组小鼠肝脏磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶β1(Phosphate AMP-activated protein kinaseβ1,p-AMPKβ1)蛋白表达均未见明显变化。10.肝细胞内Nrf2缺失对小鼠Lieber-DeCarli酒精液体饲料暴露后肝脏组织损伤及内质网应激相关蛋白表达水平4.2%液体饲料喂饲28天,各组小鼠肝脏组织增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(Poly-ADP-ribose polymerase,PARP)和Cleaved PARP蛋白表达未见明显变化。酒精液体饲料处理使小鼠肝脏结合免疫球蛋白的蛋白质(Binding immunoglobulin protein,BIP)表达升高,但基因型间无明显差异。11.髓系细胞内Nrf2缺失对小鼠Lieber-DeCarli酒精液体饲料暴露后一般情况的影响4.2%液体饲料喂饲42天,各组小鼠摄食量、体重和脏器系数的差异无统计学意义(p0.05)。液体饲料造模1周和6周后,各组小鼠体脂含量差异无统计学意义(p0.05)。12.髓系细胞内Nrf2缺失加重小鼠酒精性脂肪肝酒精液体饲料喂饲42天,与同组Nrf2-KI小鼠相比,EtOH组Nrf2-(M)KO小鼠出现更严重的脂肪肝。EtOH组Nrf2-(M)KO小鼠肝脏TG含量较同组Nrf2-KI小鼠升高(p0.05)。各组小鼠之间ALT和AST的差异均无统计学意义(p0.05)。13.髓系细胞内Nrf2缺失对小鼠Lieber-DeCarli酒精液体饲料暴露后肝脏脂代谢相关蛋白及基因表达的影响液体饲料喂饲42天,各组小鼠肝脏组织PPARα,PPARγ1,PPARγ2,过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子1α(Peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α,PGC-1α),p-AMPKβ1和AMPKβ1蛋白表达均未见明显变化。各组小鼠间甾醇调控元件结合蛋白(Sterol-regulatory element binding proteins,Srebp)和PparαmRNA表达的差异无统计学意义(p0.05)。14.髓系细胞内Nrf2缺失对小鼠Lieber-DeCarli酒精液体饲料暴露后肝脏组织炎症及纤维化相关蛋白及基因表达的影响液体饲料喂饲42天,各组小鼠间炎症反应相关基因肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,Tnfα),白介素(Interleukin 1β,IL-1β),IL-6,F4/80和IL-10 mRNA相对表达量的差异均无统计学意义(p0.05)。纤维相关蛋白转化生长因子β1(Transforming growth factorβ1,TGFβ1)和α-SMA各组小鼠间亦未见明显变化。Tgfβ1,α-SMA,Fibronectin和Collagen mRNA水平,各组小鼠间的差异均无统计学意义(p0.05)。结论:1.全身性Nrf2缺失通过降低EtOH代谢能力、加重肝脏及胰腺损伤三者综合作用导致小鼠急性EtOH暴露后低体温、低血糖和死亡率增加。Nrf2激动剂DMF,可通过上调机体抗氧化能力显著减缓小鼠EtOH暴露后的低血糖和低体温,有效逆转酒精性致死效应。2.肝细胞内Nrf2缺失使EtOH暴露后小鼠死亡率升高,死亡时间提前。在4.2%酒精液体饲料喂养下,肝细胞内Nrf2缺失使小鼠EtOH暴露后葡萄糖反应性增强,但对酒精性脂肪肝发病无明显作用。3.髓系细胞内Nrf2缺失可加重小鼠酒精性脂肪肝,但初步研究发现其并非通过影响AMPK、PPARα、PPARγ和PGC-1α等脂肪酸氧化途径。髓系细胞内Nrf2缺失对小鼠酒精性炎症反应及肝纤维化未见明显作用。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R575;R576
【部分图文】：

实验数据均以平均值（X）±标准差（SD）表示，使用 GraphPad Prism 5 进行未对的 Student's t 检验或双因素方差分析（TWO-WAY ANOVA）。当差异有统计学义时，采用 Dunnett’s 法进行组间比较。 p < 0.05 时认为差异有统计学意义。3 结果1 Nrf2 全身及肝细胞内特异性敲除小鼠基因型鉴定琼脂糖凝胶电泳显示：如图 3.1A 所示，出现 633 bp 条带为 Nrf2-WT 小鼠，出 400 bp 条带为 Nrf2- KO 小鼠，两条带同时出现则为 Nrf2-HET 小鼠。如图 3.1 B示出现 174 bp 条带即为 Nrf2-loxp-KI 小鼠，出现 200 bp 条带则为 Nrf2-loxp-WT鼠，两条条带同时出现为 Nrf2-loxp-HET 小鼠。在 Nrf2-loxp-KI 小鼠基础上进一鉴定，出现 Alb-cre 阳性条带（200 bp）的小鼠即为 Nrf2-(L)KO 小鼠；未出现 Alb-cre带的小鼠则为 Nrf2-KI 小鼠，324 bp 为内参条带（见图 C）。

观察全身 Nrf2 缺失对小鼠的影响（图3.2.1 A），结果发现急性 EtOH（6.0g / kg BW）暴露 6 h 后，Nrf2-KO 与 Nrf2-WT 两组实验小鼠血糖均出现下降，于 12 h 后逐渐回升。在整个实验期间，Nrf2-KO 小鼠与 Nrf2-WT 小鼠相比，其小鼠血糖水平始终低于 Nrf2-WT 小鼠（图 3.2.1 B）。其中，EtOH 暴露后 24 h，Nrf2-KO 血糖水平显著低于 Nrf2-WT 小鼠（p < 0.05）。如图 3.2.1C 曲线下面积

A. 小鼠急性 EtOH 暴露流程图；B. 不同时间点各组小鼠血糖水平；C .图 B 的曲线下面积； D.不同时间点各组小鼠体温水平；E.图 D 的曲线下面积；F. 各组小鼠生存曲线。注：与 Nrf2-WT相比，* p < 0.05；数据以 X ± SD 表示，n = 6 - 8。为获得足够样本量进行后续机制分析，我们采取相对较低连续两次灌胃的方式给予小鼠 4.8g / kgBW EtOH 暴露（如图 3.3.2 A），结果显示小鼠血糖与体温总体呈现先下降后回升趋势。其中，由图 3.3.2 B，C 可见，在 EtOH 暴露 24 h 后，与 Nrf2-WT小鼠相比，Nrf2-KO 小鼠血糖显著降低（p < 0.05），曲线下面积差异无统计学意义（p > 0.05）。如图 3.3.2 D，E 所示，Nrf2-KO 组各监测点体温水平均低于 Nrf2-WT组。其中，EtOH 处理 12 和 24 h 后，差异具有统计学意义（p < 0.05），曲线下面积差异具有统计学意义（p < 0.05）。可见，Nrf2-KO 小鼠在连续两次相对较低剂量 EtOH暴露引起的低血糖和低体温更为敏感。
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本文编号：2856962