TLR2mAb和TLR4mAb对DSS诱导的小鼠急性期溃疡性结肠炎干预作用的研究

发布时间：2020-10-29 14:57

　　 目的探讨TLR2单克隆抗体(Toll like receptor 2 monoantibody, TLR2mAb)和TLR4单克隆抗体(Toll like receptor 4 monoantibody, TLR4mAb)对葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium, DSS)诱导的小鼠急性期溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)的干预作用及其可能机制。 方法50只雄性BALB/c小鼠分为A～E组：对照组(A组)、UC模型组(B组)及TLR2mAb干预组(C组)、TLR4mAb干预组(D组)、TLR2mAb和TLR4mAb联合干预组(E组)。A组小鼠饮用蒸馏水7天；B-E组小鼠仅饮用5%DSS水溶液7天以产生急性期溃疡性结肠炎模型。于造模第1、3、5、7天进行干预,C、D、E干预组小鼠分别给予TLR2mAb(10μg)、TLR4mAb(10μg)、TLR2mAb(10μg)+TLR4mAb(10μg)腹腔内注射,A、B组给予腹腔内注射生理盐水,以观察TLR2mAb和TLR4mAb的干预作用。观察指标包括疾病活动指数(disease activity index, DAI)、结肠组织病理学评分(histopathological score, HS)。造模及干预7天后处死小鼠,采用Realtime-PCR法检测各组结肠黏膜TLR2、TLR4、IFN-γ、IL-4及IL-17的mRNA表达,Western-Blot法检测各组肠粘膜磷酸化p38αMAPK、c-jun、c-fos、磷酸化IKK蛋白表达,EMSA法检测NF-κB的活性变化。 结果 第一部分TLR2mAb和TLR4mAb对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠急性期溃疡性结肠炎症状及病理改变的影响： 造模结束时,模型组小鼠产生典型的腹泻、血便、体重减轻等溃疡性结肠炎表现。对照组、模型组、TLR2mAb干预组、TLR4mAb干预组、TLR2mAb和TLR4mAb联合干预组的DAI分别为0.50±0.707、9.70±2.406、6.75±3.495、7.75±3.919、5.70±3.498。模型组DAI明显高于对照组(P0.01); TLR2mAb和TLR4mAb联合干预组DAI明显低于模型组(P0.05),且明显高于对照组(P0.01); TLR2mAb干预组、TLR4mAb干预组DAI与模型组比较无统计学意义(P0.05)。 对照组、模型组、TLR2mAb干预组、TLR4mAb干预组、TLR2mAb和TLR4mAb联合干预组的HS分别为6.40±3.273、16.50±2.991、13.25±3.576、14.50±3.625、9.50±3.308。模型组HS明显高于对照组(P0.01); TLR2mAb和TLR4mAb联合干预组HS明显低于模型组(P0.01)和TLR4mAb干预组(P0.05),与对照组无统计学意义(P0.05); TLR2mAb干预组、TLR4mAb干预组HS与模型组比较无统计学意义(P0.05) 第二部分TLR2mAb和TLR4mAb对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠急性期溃疡性结肠炎肠黏膜细胞因子的影响： 对照组、模型组、TLR2mAb干预组、TLR4mAb干预组、TLR2mAb和TLR4mAb联合干预组小鼠肠黏膜TLR2mRNA表达量如下：0.26±0.397、1.96±1.558、0.64±1.030、0.39±0.594、0.42±0.461。模型组TLR2mRNA表达明显高于对照组(P0.01); TLR2mAb干预组、TLR4mAb干预组、TLR2mAb和TLR4mAb联合干预组TLR2mRNA表达明显低于模型组(P0.05),与对照组无统计学意义(P0.05)。 对照组、模型组、TLR2mAb干预组、TLR4mAb干预组、TLR2mAb和TLR4mAb联合干预组小鼠肠黏膜TLR4mRNA表达量如下：0.52±0.414、1.16±0.568、0.45±0.346、0.51±0.374、0.44±0.335。模型组TLR4mRNA表达明显高于对照组(P0.01); TLR2mAb干预组、TLR4mAb干预组、TLR2mAb和TLR4mAb联合干预组TLR4mRNA表达明显低于模型组(P0.01,P0.05,P0.01),与对照组无统计学意义(P0.05)。 对照组、模型组、TLR2mAb干预组、TLR4mAb干预组、TLR2mAb和TLR4mAb联合干预组小鼠肠黏膜IFN-γmRNA表达量如下：0.80±0.802、2.40±1.089、0.95±1.075、0.97±0.716、0.93±0.661。模型组IFN-γmRNA表达明显高于对照组(P0.01); TLR2mAb干预组、TLR4mAb干预组、TLR2mAb和TLR4mAb联合干预组IFN-γmRNA表达明显低于模型组(P0.05,P0.05,P0.01),与对照组无统计学意义(P0.05)。 对照组、模型组、TLR2mAb干预组、TLR4mAb干预组、TLR2mAb和TLR4mAb联合干预组小鼠肠黏膜IL-4mRNA表达量如下：0.12±0.107、0.86±1.185、0.02±0.025、0.02±0.025、0.03±0.024。模型组IL-4mRNA表达明显高于对照组(P0.05); TLR2mAb干预组、TLR4mAb干预组、TLR2mAb和TLR4mAb联合干预组IL-4mRNA表达明显低于模型组和对照组(P0.01)。 对照组、模型组、TLR2mAb干预组、TLR4mAb干预组、TLR2mAb和TLR4mAb联合干预组小鼠肠黏膜IL-17mRNA表达量如下：0.18±0.230、0.61±0.296、0.18±0.236、0.17±0.197、0.06±0.039。模型组IL-17mRNA表达明显高于对照组复旦大学硕士论文(P0.01)；TLR2mAb干预组、TLR4mAb干预组、TLR2mAb和TLR4mAb联合干预组IL-17mRNA表达明显低于模型组(P0.01),与对照组无统计学意义(P0.05)。 第三部分TLR2mAb和TLR4mAb对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠急性期溃疡性结肠炎TLR2和TLR4共同介导的信号通路的影响： 对照组、模型组、TLR2mAb干预组、TLR4mAb干预组、TLR2mAb和TLR4mAb联合干预组小鼠肠黏膜磷酸化P38αMAPK蛋白表达量如下：0.45±0.037、1.42±0.131、1.57±0.068、0.89±0.033、0.75±0.024。模型组、TLR2mAb干预组、TLR4mAb干预组磷酸化P38αMAPK蛋白表达明显高于对照组(P0.01)；TLR4mAb干预组、TLR2mAb+TLR4mAb干预组蛋白表达明显低于模型组(P0.01),TLR2mAb干预组蛋白表达与模型组无明显差异(P0.05)；TLR2mAb+TLR4mAb干预组蛋白表达与对照组无明显差异(P0.05)。 对照组、模型组、TLR2mAb干预组、TLR4mAb干预组、TLR2mAb和TLR4mAb联合干预组小鼠肠黏膜c-jun蛋白表达量如下：0.28±0.060、1.17±0.074、1.00±0.078、0.75±0.183、0.42±0.062。模型组、TLR2mAb干预组、TLR4mAb干预组c-jun蛋白表达明显高于对照组(P0.01); TLR4mAb干预组、TLR2mAb+TLR4mAb干预组蛋白表达明显低于模型组(P0.01), TLR2mAb干预组蛋白表达与模型组无明显差异(P0.05)；TLR2mAb+TLR4mAb干预组蛋白表达与对照组无明显差异(P0.05)。 对照组、模型组、TLR2mAb干预组、TLR4mAb干预组、TLR2mAb和TLR4mAb联合干预组小鼠肠黏膜c-fos蛋白表达量如下：0.46±0.013、0.48±0.010、0.46±0.017、0.45±0.012、0.45±0.015。组间均无明显差异(P0.05)。 对照组、模型组、TLR2mAb干预组、TLR4mAb干预组、TLR2mAb和TLR4mAb联合干预组小鼠肠黏膜磷酸化IKK蛋白表达量如下：0.11±0.022、0.66±0.013、0.34±0.014、0.18±0.010、0.14±0.013。模型组、TLR2mAb干预组、TLR4mAb干预组磷酸化IKK蛋白表达明显高于对照组(P0.01); TLR2mAb、TLR4mAb、TLR2mAb+TLR4mAb干预组蛋白表达明显低于模型组(P 0.01); TLR4mAb、TLR2mAb+TLR4mAb干预组蛋白表达明显低于TLR2mAb干预组(P0.01)；TLR2mAb+TLR4mAb干预组蛋白表达与对照组无明显差异(P0.05)。 对照组、模型组、TLR2mAb干预组、TLR4mAb干预组、TLR2mAb和TLR4mAb联合干预组小鼠肠黏膜NF-κB的活性如下：5.18±0.685、21.24±1.150、18.13±1.451、6.15±0.429、6.12±0.575。模型组NF-κB表达明显高于对照组(P0.01); TLR2mAb干预组、TLR4mAb干预组、TLR2mAb和TLR4mAb联合干预组IL-17mRNA表达明显低于模型组(P0.01),与对照组无统计学意义(P0.05)。 结论DSS诱导的急性期溃疡性结肠炎小鼠结肠粘膜的TLR2和TLR4表达明显高于正常。TLR2mAb和HR4mAb联合干预可以缓解溃疡性结肠炎模型小鼠腹泻、血便、体重下降的症状,减轻结肠黏膜组织炎症反应,下调细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17的表达,并降低信号传导通路中磷酸化P38αMAPK、c-jun、磷酸化IKK及NF-κB蛋白表达,故对DSS诱导的小鼠急性期溃疡性结肠炎模型有一定的干预作用,且二者有协同作用。TLR2mAb主要通过抑制NF-κB通路中关键蛋白的表达,而TLR4mAb主要通过抑制P38MAPK-c-jun通路和NF-κB通路中关键蛋白的表达,从而抑制下游细胞因子过度表达,减轻小鼠结肠黏膜炎症损伤。
【学位单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2010
【中图分类】：R574.62
【部分图文】：

讨论一、TLRZmAb和TLR4InAb对急性UC模型小鼠肠薪膜TLRZ、TLR4表达的影响Toll样受体(TLRs)是一族具有信号转导功能的天然免疫识别受体(PatterReC。gniti。nReC即t。rs，PRR)，主要识别病原微生物所共有的高度保守的病原关分子模式(pathogenaSS。Ciatedm。leCularpattern，PAMP)。不同的TLRS可识别不同的以MP，TLRZ与TLRI或TLR6形成异二聚体，主要识别革兰阳性菌的肤糖(PGN)和磷壁酸(LTA)，TLR4与CD14、LBP结合主要识别革兰阴性菌脂多糖(LP!‘:，’〕。TLRS分布也十分广泛，主要表达于单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、形核细胞、T与B淋巴细胞、NK细胞及肠道上皮细胞等。最近研究表明生理状态下正常的TLRS信号传导通路可以维持肠勃膜的完整和对共生微生物的内环境的稳态;而在病理情况下，该信号传导通路的异常表达会导致结肠勃膜的急、慢性

复旦大学硕士论支架及胶放入电泳槽中，上下槽各加入TriS一甘氨酸电泳缓冲液;通电源，以电压120V、电流60mA电泳，等到澳酚蓝跑出分离胶即可电泳。.3WesternBloting实验流程:的处理:小心将胶放入100mL阴极buffer，平衡15min;的处理:用尺子量作胶的大小，剪同样大小的一片PVDF膜，用甲醇()浸泡155，再用双蒸水浸泡Zmin，取出用阳极bufferll平衡IOmin干法转膜:按下面顺序放胶、膜和滤纸，插上电源，1.ZmA/cmZ转膜................一阴极
【参考文献】

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2 胡仁伟;欧阳钦;陈曦;常玉英;白爱平;王瑞华;张虎;;近15年我国炎症性肠病文献分析[J];胃肠病学;2007年02期

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本文编号：2861060