肝星状细胞分泌外泌体改变肝非实质细胞代谢机制的研究
发布时间：2020-11-12 17:24
目的:肝纤维化是一种可逆的创伤性修复过程,细胞外基质合成增多降解相对减少;作为肝脏内细胞外基质主要来源的肝星状细胞的活化是肝纤维化中的关键病理病变;外泌体是一种细胞分泌的膜性小囊泡,在细胞通讯中发挥重要作用。我们推测肝星状细胞活化过程中释放的外泌体可参与肝脏受损修复。本文旨在探索肝星状细胞外泌体如何影响肝纤维化的发生发展,并从细胞能量代谢的角度如有氧糖酵解(瓦尔堡效应)的角度探讨外泌体对肝星状细胞活化的调控机制,以及对肝内巨噬细胞、内皮细胞的可能作用,进一步研究肝纤维化发生发展机制,为逆转肝纤维化提供理论依据。方法:提取肝星状细胞外泌体,用电镜、Western blot和乙酰胆碱脂酶(AchE)活性测定试剂盒鉴定外泌体;以CoCl_2缺氧或LPS诱导处理人肝星状细胞LX-2,继而用Hif-1抑制剂2-ME或外泌体抑制剂GW4869抑制Hif-1表达或外泌体分泌,用AchE活性测定试剂盒测定外泌体分泌,Western blot检测Hif-1或肝星状细胞活化标记分子α-SMA,免疫荧光染色技术(Immunofluorescence,IF)检测2-NBDG摄取;用Western blot和IF检测以CoCl_2缺氧或LPS诱导处理LX-2细胞内及培养上清外泌体内糖酵解相关分子GLUT1和PKM2表达;将活化的肝星状细胞外泌体与静息肝星状细胞、小鼠腹腔巨噬细胞、人脐血管内皮细胞共孵育,IF检测外泌体的摄取,Western blot检测GLUT1、PKM2、α-SMA和VEGF的表达。结果:LX-2细胞外泌体具有外泌体典型结构,表达外泌体特异性分子,具有乙酰胆碱脂酶活性;LX-2细胞缺氧或LPS处理后,细胞外泌体分泌增多,2-ME抑制Hif-1表达,外泌体分泌受到抑制;GW4869抑制外泌体分泌,缺氧或LPS处理后LX-2细胞内Hif-1和活化标记分子α-SMA表达受到抑制,缺氧条件下LX-2细胞葡萄糖摄取受到抑制。LX-2细胞缺氧或LPS处理后,细胞内和上清外泌体中糖酵解相关分子GLUT1和PKM2表达升高;活化的LX-2细胞外泌体能引起静息的LX-2细胞活化,GLUT1、PKM2、α-SMA和VEGF表达升高;活化的LX-2细胞外泌体能诱导小鼠腹腔巨噬细胞和人脐血管内皮细胞内GLUT1和PKM2表达升高。结论:肝星状细胞可分泌外泌体,其外泌体分泌受Hif-1核转录因子调控;外泌体参与LX-2细胞活化和能量代谢进程;肝星状细胞活化时产生的外泌体含有GLUT1和PKM2等糖酵解相关分子,其外泌体可被静息肝星状细胞、巨噬细胞和内皮细胞受纳,并引起受纳细胞内GLUT1和PKM2升高,提示受纳细胞发生瓦尔堡效应。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R575.2
【部分图文】：
图 1.LX-2 人肝星状细胞可分泌外泌体。LX-2 细胞用去外泌体培养液培养 24h 后，收集上清液用外泌体提取试剂盒提取外泌体。（A）2%磷钨酸处理外泌体，透射电子显微镜下观察，采集像分析；（B）用 Western blot 检测外泌体中 GRP94、TSG101 和 CD9 蛋白的表达，并用 LX-2胞裂解液作为对照；（C）外泌体 AchE 活性用乙酰胆碱脂酶试剂盒测定，PBS 为阴性对照。该验用不同批次样品重复 3 次，并作统计学分析（p<0.05），结果用 Mean ±SD 表示。
华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文2．LX-2 肝星状细胞外泌体的分泌受 Hif-1 核转录因子的调控。本课题组前期已证实在 CoCl2缺氧诱导和 LPS 炎症因子刺激时，LX-2 细胞内缺诱导因子 Hif-1 表达升高，且 Hif-1 可以调控肝星状细胞活化。有研究表明，Hif-1表达是影响外泌体分泌的重要因素。AchE 活性用于检测缺氧和 LPS 刺激条件下外体的分泌量，结果表明，缺氧和 LPS 刺激条件下，LX-2 细胞外泌体分泌升高（图 2A）Hif-1 特异性抑制剂 2ME 抑制 Hif-1 表达时，LX-2 细胞外泌体分泌受到抑制（图 2A）Western blot 检测外泌体特异性蛋白 TSG101 表达，结果与 AchE 活性检测一致，缺和 LPS 刺激促进 LX-2 细胞外泌体分泌，2ME 抑制 Hif-1 可明显抑制 LX-2 外泌体分（图 2B）。以上结果证实，Hif-1 调控 LX-2 肝星状细胞外泌体的分泌。
30图 3. 抑制外泌体的分泌可抑制缺氧或 LPS 诱导下 LX-2 肝星状细胞活化和 Hif-1 表达，并阻遏胞缺氧条件下葡萄糖吸收。（A）将 LX-2 肝星状细胞用 10μM 外泌体抑制剂 GW4869 预处理后，用 100μM CoCl2诱导细胞缺氧或用 2ug/ml LPS 刺激细胞，在 0h、1h 和 8h 收集细胞内总蛋白Western blot 检测 Hif-1、α-SMA 以及内参 β-actin 的表达。（B）在 100μM CoCl2刺激条件下，（C在 2ug/ml LPS 刺激条件下，Hif-1、α-SMA 的表达水平做统计学分析，该实验用不同批次样品重3 次，结果用 Mean ± SD 表示，*：P<0.05，**：P<0.01, ***：P<0.001。（D）将 LX-2 肝星状胞接种于放置了盖玻片的六孔板中，control 组不作处理，CoCl2组诱导细胞缺氧 1h，GW4869同时加入 GW4869 和 100μM CoCl2处理细胞 1h，加入带绿色荧光的 2-NBDG，用免疫荧光显微观察细胞对葡萄糖的吸收，绿色：2-NBDG，蓝色：DAPI，200×。
【参考文献】
本文编号：2881021
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R575.2
【部分图文】：
图 1.LX-2 人肝星状细胞可分泌外泌体。LX-2 细胞用去外泌体培养液培养 24h 后，收集上清液用外泌体提取试剂盒提取外泌体。（A）2%磷钨酸处理外泌体，透射电子显微镜下观察，采集像分析；（B）用 Western blot 检测外泌体中 GRP94、TSG101 和 CD9 蛋白的表达，并用 LX-2胞裂解液作为对照；（C）外泌体 AchE 活性用乙酰胆碱脂酶试剂盒测定，PBS 为阴性对照。该验用不同批次样品重复 3 次，并作统计学分析（p<0.05），结果用 Mean ±SD 表示。
华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文2．LX-2 肝星状细胞外泌体的分泌受 Hif-1 核转录因子的调控。本课题组前期已证实在 CoCl2缺氧诱导和 LPS 炎症因子刺激时，LX-2 细胞内缺诱导因子 Hif-1 表达升高，且 Hif-1 可以调控肝星状细胞活化。有研究表明，Hif-1表达是影响外泌体分泌的重要因素。AchE 活性用于检测缺氧和 LPS 刺激条件下外体的分泌量，结果表明，缺氧和 LPS 刺激条件下，LX-2 细胞外泌体分泌升高（图 2A）Hif-1 特异性抑制剂 2ME 抑制 Hif-1 表达时，LX-2 细胞外泌体分泌受到抑制（图 2A）Western blot 检测外泌体特异性蛋白 TSG101 表达，结果与 AchE 活性检测一致，缺和 LPS 刺激促进 LX-2 细胞外泌体分泌，2ME 抑制 Hif-1 可明显抑制 LX-2 外泌体分（图 2B）。以上结果证实，Hif-1 调控 LX-2 肝星状细胞外泌体的分泌。
30图 3. 抑制外泌体的分泌可抑制缺氧或 LPS 诱导下 LX-2 肝星状细胞活化和 Hif-1 表达，并阻遏胞缺氧条件下葡萄糖吸收。（A）将 LX-2 肝星状细胞用 10μM 外泌体抑制剂 GW4869 预处理后，用 100μM CoCl2诱导细胞缺氧或用 2ug/ml LPS 刺激细胞，在 0h、1h 和 8h 收集细胞内总蛋白Western blot 检测 Hif-1、α-SMA 以及内参 β-actin 的表达。（B）在 100μM CoCl2刺激条件下，（C在 2ug/ml LPS 刺激条件下，Hif-1、α-SMA 的表达水平做统计学分析，该实验用不同批次样品重3 次，结果用 Mean ± SD 表示，*：P<0.05，**：P<0.01, ***：P<0.001。（D）将 LX-2 肝星状胞接种于放置了盖玻片的六孔板中，control 组不作处理，CoCl2组诱导细胞缺氧 1h，GW4869同时加入 GW4869 和 100μM CoCl2处理细胞 1h，加入带绿色荧光的 2-NBDG，用免疫荧光显微观察细胞对葡萄糖的吸收，绿色：2-NBDG，蓝色：DAPI，200×。
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 李寿星;从一摩尔葡萄糖氧化产生38分子ATP说起──对农业院校教材使用量与单位深层次问题的调查[J];湖北农学院学报;1998年03期
本文编号：2881021
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