大鼠肝前体细胞的体外双向分化模型的建立及基于iTRAQ技术的WB-F344细胞向胆管细胞分化过程中的蛋白质组学研究

发布时间：2020-11-13 23:44

　　 本研究通过选用不同生物及化学分化体系对由大鼠2-AAF/PH　模型分离出的肝卵圆细胞及WB-F344　细胞进行体外诱导,诱导细胞肝、胆管上皮细胞标志物表达上调,干细胞标志物表达减弱或消失,形态学也发生相应改变,实现体外培养肝前体细胞可控的向肝细胞或胆管上皮细胞分化。同时我们通过联合运用iTRAQ技术及质谱技术研究肝WB-F344细胞在体外向胆管细胞分化过程中的差异蛋白的动态表达,筛选与分化信号转导有关及可能做为卵圆细胞特异标志物的蛋白。质谱结果鉴定出了1278个差异蛋白,对67个发生明显上调或下调的蛋白进行了鉴定及功能学检测。本研究表明ITRAQ技术是研究培养细胞动态差异蛋白组学的有效方法,检验出的差异蛋白可能与卵圆细胞向胆管上皮细胞分化的信号转导有关。　
【学位单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2007
【中图分类】：R575
【部分图文】：

一、大鼠 2-AFF/PH 模型分离肝卵圆细胞的特征：2-AFF灌喂大鼠在行2/3肝切除术后约4－12天内可见胆管增生反应和胆管周围的卵圆细胞反应，于第9 天达到最明显。卵圆细胞增生部位多位于汇管区及小叶间胆管附近，所见到的肝卵圆细胞体积较小，卵圆细胞核呈卵圆形，胞质较少，嗜酸性弱，肝卵圆细胞大小及分布不均匀(图1-A、B)。呈簇状分布且由汇管区向肝实质内延伸。经二部胶原酶消化法分离出的细胞进行原代培养，5 天后我们即可见克隆样生长的上皮样细胞(图1-C)形体小，核浆比例大，细胞折光性强。经纯化后卵圆细胞记为第一代，待细胞长至80%满时1:3 传代,约3－5 天传一代。相差显微镜观察细胞直径约10-15μm，呈铺路石样排列多角形。形态较均一，折光性强，核大，卵圆形，胞浆少，核仁明显，细胞之间有接触抑制(图1-D)。细胞融合培养时可见迅速消亡。

且抑制作用随浓度增高及作用时间延长，而 0.75、2.25mmol/L 作用组丁酸钠其光密度值与对照组无明显差别（图 1-2A）；6.25mmol/L 丁酸钠诱导组细胞生长状况不佳，培养第 2 天即可见到较多细胞脱壁死亡，残余折光性弱，边界模糊(图 1-2B)。在以下分化实验中我们选取 3.75 和 5.25mmol/L 丁酸钠进行诱导实验。几种分化体系对培养细胞均有抑制作用，其抑制作用在卵圆细胞和 WB－F344 细胞间无明显区别。图 1-3 为卵圆细胞在各分化体系中的生长曲线图:丁酸钠体系对诱导细胞的抑制作用最强，显微镜下观察该体系内细胞数量明显少于对照组；HGF+EGF 体系对诱导细胞生长抑制最低，镜下可发现卵圆细胞在该体系中形态于数量与对照组无明显区别，WB-F344 细胞发生形态学改变的细胞较多，但周围仍可观察到较多相对正常的细胞。

图 1-3 不同分化体系作用于卵圆细胞后细胞的增殖情况（二）分化体系对细胞形态学的影响卵圆细胞在丁酸钠诱导下，处理 2 天后相差显微镜显示细胞形态展面积增大，生长停止，细胞核变大，胞浆也相应增加，核浆比减小（B）。第三天可见出现双核或多核细胞第七天基本上见不到铺路石样卵圆3.75、4.5 mmol/L 的丁酸钠诱导的 WB-F344 细胞形态改变与卵圆细胞处理 1 天后相差显微镜显示 WB-F344 细胞形态变平，大小要略小于诱卵圆细胞，细胞成圆形或椭圆形，生长减慢，细胞间距离增大，细胞核核质比减小，5 天基本上见不到原始状态的 WB-F344 细胞（图 1-5 C）。在 Matrigel 上培养的卵圆细胞和 WB－F344 细胞在形态学上有均变，相差显微镜显示培养第 2 天细胞间可见到绳索样结构，由拉伸成的细胞组成；其余细胞的生长停止，细胞呈岛样聚集。相对对照细胞，
【共引文献】

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本文编号：2882799