神经营养因子MANF通过调控巨噬细胞功能促进药物诱导肝损伤修复的机制研究

发布时间：2020-11-15 12:58

　　 目的:对乙酰氨基酚(APAP)摄入过量是引起急性肝衰竭的重要原因。肝细胞损伤后,单核细胞浸润到肝脏,参与炎症反应;炎性单核细胞随后转化为修复型巨噬细胞,促进损伤修复。目前调控单核巨噬细胞功能转化的机制仍不清楚。前期研究发现,中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(MANF)在小鼠髓系细胞中缺失,会延缓APAP诱导的肝脏损伤(AILI)修复,降低损伤恢复期修复型巨噬细胞的比例和数量。我们推测,MANF通过调控肝脏单核巨噬细胞功能来促进AILI修复。本课题使用髓系细胞特异性MANF敲除鼠,hrMANF,阐释单核巨噬细胞来源的MANF促进AILI修复;通过流式分析,qPCR等揭示MANF调控单核巨噬由促炎型向修复型转化的分子机制,单核巨噬细胞的调控机制的阐明,将为以MANF和单核巨噬细胞为靶点治疗药物性肝损伤提供理论和实验依据。方法:构建髓系细胞特异性缺失MANF的基因缺陷小鼠MANF~(fl/fl)Lyz2-Cre-T(MYEL manf~(-/-))及肝细胞特异性缺失MANF的基因缺陷型小鼠MANF~(fl/fl)Alb-Cre-T(HEPA manf~(-/-));给小鼠腹腔注射APAP(300mg/kg)诱导实验性APAP诱导肝损伤(AILI)模型;利用流式细胞术检测MANF特异性敲除小鼠肝脏免疫细胞群体分布是否发生变化;通过检测血清中谷丙转氨酶(ALT)含量及肝组织HE染色评价肝损伤严重程度;qPCR方法检测AILI小鼠肝组织炎性细胞因子及趋化因子的表达;增殖特异性抗体Ki67对肝脏粒细胞巨噬细胞染色,检测细胞增殖情况;分离小鼠外周血白细胞,检测CCR2~+单核细胞的比例;AILI修复期通过尾静脉注射外源补充人源重组MANF,检测小鼠肝损伤情况。结果:MANF缺失不影响肝脏免疫细胞群体分布;MYEL manf~(-/-)鼠肝脏损伤恢复受阻;MYEL manf~(-/-)鼠肝脏炎症程度高于C57BL/6对照鼠;MYEL manf~(-/-)鼠注射APAP后肝脏浸润的单核细胞数量高于野生鼠,但损伤后期Ly6C~(low)修复型巨噬细胞比例显著低于野生型鼠;MANF缺失后MYEL manf~(-/-)鼠肝脏单核/巨噬细胞增殖能力显著增强;MYEL manf~(-/-)鼠外周血CCR2~+单核细胞增高;hrMANF促进肝损伤修复。结论:MANF可能是AILI中一个重要调节分子,它通过抑制单核细胞表达CCR2,调节单核细胞浸润;并介导促炎性Ly6C~(hi)巨噬细胞向修复型Ly6C~(low)巨噬细胞转换,促进肝脏损伤修复。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R575
【部分图文】：

25图 1 WT 鼠、HEPA manf-/-鼠及 MYEL manf-/-鼠肝脏淋巴细胞比例。igure1 .The proportion of liver lymphocytes in WT mice HEPA manf-/-and MYEL manf-/-mic

安徽医科大学硕士学位论文通过 WT 对照鼠，HEPAmanf-/-鼠和 MYELmanf-/-鼠的对比，我们发现在损修复期（48h，72h，96h）MYEL manf-/-鼠的血清中 ALT 水平较高，而 HEPAanf-/-鼠和 WT 对照鼠相比无显著性差异。肝脏组织 H&E 染色也显示在损伤修期， MYEL manf-/-鼠肝脏仍有大量的淋巴细胞浸润和坏死肝细胞，而 WT 对鼠和 HEPAmanf-/-鼠肝脏组织已基本修复。结果表明肝细胞缺失 MANF 对ILI 过程中肝损伤及肝脏修复无影响，但是髓系细胞缺失 MANF 后影响了小鼠脏的修复能力。

图 3. APAP 注射后 MYELmanf-/-鼠和 WT 鼠肝脏中相关基因的表达水平。Fig.3. Expression levels of genes related to liver injury in MYELmanf-/-mice and WT mice afterAPAP challenge.小鼠腹腔注射 APAP（300mg/kg）诱导急性肝损伤，于不同时间点（0h，12h，24h，48h，72h，96h）收集小鼠的肝组织，通过 RT-PCR 检测肝脏中炎性细胞因子 TNF-α，IL-1β，NOS2，Ym-1，以及细胞因子 IL-10 和 CD86 的表达情况，结果如图三所示。3.4 MYEL manf-/-鼠注射 APAP 后肝脏浸润的单核细胞数量高于野生鼠，但损伤后期 Ly6Clow修复型巨噬细胞比例显著低于野生型鼠在 APAP 诱导的肝损伤模型中，粒细胞首先浸润至肝脏参与炎症反应，而巨噬细胞由于其异质性，对小鼠的损伤及修复发挥着至关重要的作用[23]。因此我们猜测 MYEL manf-/-鼠在 AILI 过程中肝损伤修复受阻且伴随着炎症加强是否与这
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本文编号：2884785