肠源性和外源性内毒素在酒精诱导的大鼠胰腺纤维化发生学作用的实验研究

发布时间：2020-11-15 19:55

　　 胰腺纤维化是酒精性慢性胰腺炎(ACP)的一个主要病理学特征,其中胰腺星状细胞(PSC)起着关键作用。静止期PSC可被酒精、酒精代谢产物和活性氧化物激活,使其转化为肌纤维母细胞样细胞,表达细胞骨架蛋白α平滑肌肌动蛋白(α-SMA),并具有增殖、合成包括I型胶原(Col1)在内的细胞外基质(ECM)蛋白的能力。ACP纤维形成过程被认为是酒精诱导胰腺组织损伤后在活化巨噬细胞(Mφ)和PSC之间基于细胞因子相互作用而引起的。事实上,仅有5-10%的酗酒者最终出现具有临床症状的胰腺炎,表明单纯酒精因素通常不足以导致临床足以诊断的胰腺炎。啮齿类动物模型和患者队列研究均表明,饮酒会导致肠道微生态失调和肠粘膜通透性增加,引起内毒素血症。近十年来,革兰氏阴性细菌内毒素脂多糖(LPS)被认为是ACP发生过程中纤维化形成和PSC激活的触发因素。最近,我们的研究发现伴有内毒素血症的ACP患者血清中单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α),调节激活正常T细胞表达和分泌因子(RANTES)和转化生长因子β1(TGF-β1)水平均提高。体外研究我们发现LPS可激活Mφ和PSC的Toll样受体4(TLR4),产生趋化因子MCP-1、MIP-1α和RANTES与转化生长因子TGF-β1。尽管已经知道LPS在ACP发病机制中具有有害作用,利用外源性LPS评价内毒素在ACP发病机制中的作用仍然存在局限性。目前尚不清楚LPS在ACP胰腺纤维化形成过程中是启动因素还是加重因素或两者兼而有之。此外,ACP发病过程中Mφ和PSC之间的相互作用以及炎症和纤维化发生学之间的分子调节机制仍然有待于阐明。本研究我们首先阐明慢性酒精喂养大鼠肠源性内毒素LPS水平和胰腺I型胶原含量的关系;进而我们使用慢性酒精喂养加LPS反复注射大鼠模型与Mφ和PSC细胞模型阐述LPS加强TGF-β1信号通路和胰腺纤维化在ACP发病机制的作用。本论文共分两部分:第一部分:肠源内毒素对慢性酒精喂养大鼠胰腺I型胶原产生的影响目的:本研究旨在评价慢性酒精喂养大鼠门静脉LPS浓度与胰腺Col1含量之间的关系。方法:雄性SD大鼠66只被随机分为两组,分别给予Lieber-De Carli等热量对照(CON)液体饮食和酒精(ALC)(15 g/kg/d)液体饮食。各11只CON或ALC喂养大鼠在第8,9或10周末致死。动态比浊法测定门静脉血浆LPS含量,HE染色用于评估胰腺炎损伤程度,苯胺蓝胶原染色用于评价胰腺纤维化程度。免疫组织化学检测胰腺组织α-SMA和F4/80分别用于识别PSCs和Mφs;RT-q PCR检测胰腺标本Col1和TLR4 m RNA;Western Blot测定胰腺标本TLR4蛋白;ELISA检测胰腺趋化因子和TGF-β1。结果:与CON大鼠相比10周末ALC喂养大鼠胰腺炎症评分升高,两组之间胶原沉积无显著性差异。ALC喂养大鼠门静脉LPS水平和胰腺TLR4、Col1A1 m RNA及蛋白水平都呈现时间依赖性增加,高峰发生在10周末。此外,在8周末ALC喂养大鼠胰腺TLR4和Col1A1 m RNA表达量与CON大鼠相比明显增加,而门静脉LPS水平无明显变化。10周末ALC喂养大鼠胰腺PSC和Mφ数量及趋化因子(MCP-1,MIP-1α和RANTES)、TGF-β1或Col1A1的表达都显著增加,它们各自与门静脉LPS水平呈正相关。结论:本研究表明肠源性内毒素LPS与酒精诱导胰腺纤维化有关,靶向细菌内毒素有可能成为ACP比较有前景的治疗策略。第二部分:外源性LPS通过上调TGF-β1信号通路增加大鼠胰腺纤维化目的:本研究旨在探讨外源性LPS调节TGF-β1信号传导和胰腺纤维化的机制。方法:22只120 g±20 g雄性SD大鼠喂养Lieber-De Carli酒精(ALC)液体饮食10周,在最后3周分成LPS注射组和非LPS注射组。LPS组于8,9,10周末每周经尾静脉注射LPS(3 mg/kg)1次,对照组尾静脉注射生理盐水1 ml。10周末接受LPS或生理盐水24 h后大鼠被异氟烷麻醉,留取胰腺组织块,其中部分组织块放入10%中性福尔马林液固定,用于制备石蜡切片,部分组织块放入液氮中保存。采用本研究室经RSV启动子/增强子驱动SV40 T抗原建立的永生化大鼠胰腺星状细胞系(RP-2细胞)进行体外研究。采用淋巴细胞分离液分离大鼠末梢血单核细胞,经粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)诱导培养6天获得组织Mφs用于LPS体外造模研究。苯胺蓝胶原染色用于评价胰腺纤维化程度。免疫组织化学检测胰腺组织TLR4,BAMBI,α-SMA和F4/80,后两者分别用于识别PSC和Mφ;免疫荧光双染用于识别胰腺组织TLR4+Mφs/TLR4+PSC或者TGF-β1+Mφ/TGF-β1+PSC。RT-q PCR用于测定RP-2细胞Col1A1、α-SMA、TLR4和BAMBI m RNA水平;Western blot用于测定RP-2细胞Col1和α-SMA蛋白水平与评价TGF-β1/Smad2/3和TLR4/My D88/NF-k B信号通路;ELISA用于测定胰腺标本与Mφ和RP-2细胞Col1A1和TGF-β1蛋白含量。结果:与单纯ALC喂养大鼠相比,LPS反复注射可显著增加ALC喂养大鼠胰腺胶原产生和PSC活化。在ALC喂养大鼠加上LPS反复注射可引起胰腺TLR4或TGF-β1过表达,TLR4+或TGF-β1+Mφ或PSC数量增加。体外实验显示LPS可上调Mφ或RP-2细胞TLR4或TGF-β1产生。在血清饥饿的RP-2细胞LPS单独或与TGF-β1联合刺激下可显著提高Col1和α-SMA产生及Smad2和Smad3磷酸化。LPS可抑制TGF-β1伪受体BAMBI产生,其可被TLR4干扰RNA(Si-TLR4 RNA)或My D88/NF-k B抑制剂拮抗。此外,Si-BAMBI RNA敲除BAMBI可显著加强RP-2细胞TGF-β1信号通路。结论:本研究表明LPS通过PSC自分泌和Mφ旁分泌途径增加TGF-β1产生,LPS通过激活TLR4/My D88/NF-k B通路抑制BAMBI表达,上调PSC中TGF-β1信号通路。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R576
【部分图文】：

图 1.1 LPS-TLR4 信号通路模式图-TLR4 通路与 NF-κB 通路的关系 为一个转录因子蛋白家族，包括 5 个亚单位：Rel（cR-κB3）、RelB 和 p50（NF-κB1）、p52（NF-κB2）。其中源和/或异源二聚体与靶基因上特定的 DNA 序列（-κB因转录，不同的 NF-κB 二聚体在选择结合序列时可能略 通过不同的二聚体的形式对不同基因表达进行激活或

吉 林 大 学 博 士 学 位 论 文34图2.1 酒精对大鼠胰腺炎症反应和胶原沉积的作用对照饲料喂养（CON）和酒精喂养（ALC）大鼠胰腺组织典型HE染色切片。1个（A）或多个炎细胞浸润和腺泡细胞水肿（B）。ALC喂养大鼠胰腺组织学评分高于CON组（C）。胰腺组织内胶原沉积面积计量分析两组之间无统计学差异（D）。（放大倍数，×400；**P<0.01）2.4.2 酒精暴露大鼠 Col1A1 mRNA 和蛋白质含量呈时间依赖性增加由于 Col1 是正常和疾病状态下胰腺 ECM 的主要成分[61,62]，我们分别在第 8、9 或 10 周末通过 qRT-PCR 和 ELISA 法测量了各组胰腺组织样本中 Col1A1 mRNA 或蛋白质含量。结果显示：酒精喂养大鼠胰腺 Col1A1mRNA 和蛋白含量均呈时间依赖性增加，第 10 周末达到最高水平。然而，与对照大鼠相比 8 周末酒精喂养大鼠胰腺 Col1A1 mRNA 表达显著增强，Col1A1 蛋白水平尽管在酒精喂养组增加了 39%，但是没有统计学意义 (图

图 2.2 酒精喂养组（ALC）大鼠胰腺中 Col1A1 mRNA 和蛋白的含量第 8，9，10 周末分别收集 ALC 组和 CON 组大鼠胰腺组织标本，ALC 喂养大鼠胰腺中 Col1A1 mRNA(A)和蛋白(B)含量呈现时间依赖性增加，最高水平出现在第 10周末。（*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001）2.4.3 慢性酒精暴露对 PSC 和巨噬细胞活化的影响由于 PSC 在疾病状态下胰腺的 ECM 合成中发挥关键作用，其与与Mφ相互作用，通过细胞因子调节而启动 ACP 纤维形成[63,64]，本研究采用Col1和α-SMA双重免疫组织化学染色检测胰腺PSC中是否具有Col1沉积。结果发现绝大多数 Col1 能在 PSC 中检测到，而产生 Col1 的 PSC 在对照大
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本文编号：2885141