两种不同肝纤维化相关细胞因子shRNA表达载体的构建

发布时间：2020-11-16 05:16

　　 目的:结缔组织生长因子(CTGF)是新近发现的一种促肝纤维化的重要细胞因子,是转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)信号传导途径的下游效应介质。CTGF可直接介导原代肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)活化、增殖及迁移,还能促进活化HSC的合成及分泌细胞外基质(extracellular matrix,ECM)。金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)也是TGF-β信号传导途径的下游效应介质,在肝纤维化发生时,它主要由激活的HSC表达。TIMP-1不仅抑制基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)活性阻止胶原降解,也通过抑制HSC凋亡、促进胶原分泌而在肝纤维化病情进展中发挥关键作用。所以,减少CTGF和TIMP-1的表达,可以减轻肝纤维化程度。本研究旨在构建以大鼠CTGF或TIMP-1基因为靶点的短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)表达载体,为进一步探索肝纤维化的基因治疗提供有力工具。方法:根据前期筛选出的对CTGF和TIMP-1基因最有效的RNA干扰靶位,即CTGF基因1560～1580nt和TIMP-1基因412～432nt ,按照RNA干扰(RNA interference,RNAi)序列设计原则,各设计1对含有短发夹结构的RNAi靶点序列,退火形成双链DNA,分别克隆到经双酶切后的质粒载体psiRNA-h7SKGFPzeo,构建成含目的靶基因片段的重组质粒载体psiRNA-GFP-CTGF和psiRNA-GFP-TIMP-1,并对重组质粒进行双酶切琼脂糖电泳和测序鉴定。结果:酶切证实以大鼠CTGF或TIMP-1基因为靶点的表达shRNA的目的基因片段分别被成功的克隆到质粒载体psiRNA-h7SKGFPzeo中,测序结果证明重组质粒载体的插入序列与设计的靶基因片段完全一致。结论:成功构建靶向大鼠CTGF和TIMP-1最有效的RNA干扰靶位的shRNA表达质粒重组体,为进一步探索肝纤维化基因治疗的新途径打下了实验基础。
【学位单位】：泸州医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2009
【中图分类】：R575.2
【部分图文】：

快速旋转含有低温冻干的质粒的 EP 管，使质粒 DNA 成为球形，用 20 μL 的无菌蒸馏水溶解 20μg 的质粒，使之形成质粒溶液 1μg/μl ，保存于-20 ° C 待用。

将平板置于室温直至液体被吸收。（5）倒置平皿，于37℃恒温细菌培养箱培养，14–16小时后可出现浅蓝色菌落(见图2)。需注意：有的菌落可能为浅蓝色，甚至显色不明显。（6）将出现蓝色菌落的平板放于4℃冰箱数小时，可以使蓝色菌落显色充分。

轻轻混匀后，37°C 水浴加热 3h，后置 80℃水浴 20min 灭活，即用或-20℃保存备用。c. Hind III单酶切产物0.8﹪琼脂糖电泳鉴定，见图3M: maker DNA 6μl,6×缓冲液 1μl.1：提取质粒10μl，6×缓冲液（0.25﹪溴酚蓝）2μl.2：提取质粒10μl，6×缓冲液（0.25﹪溴酚蓝）2μl.3：空载质粒5μl，6×缓冲液（0.25﹪溴酚蓝）1μl.2.3 重组质粒psiRNA-GFP-CTGF和 psiRNA-GFP-TIMP-1的制备2.3.1 空载质粒psiRNA-h7SKGFPzeo用内切酶ACC 65I和Hind III双酶切和酶切产物琼脂糖电泳a.空载质粒psiRNA-h7SKGFPzeo用内切酶ACC 65I和Hind III双酶切
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