肠缺血再灌注导致全身炎症反应及多器官功能障碍综合征的机理研究

发布时间：2020-11-18 22:21

　　 研究背景和目的： 肠缺血再灌注(intestinal ischemia-reperfusion，IIR)是发生多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的重要病理生理过程。全身炎症反应(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)是IIR后MODS发生的重要发病机理，早期干预炎症反应，积极防治MODS，是降低危重病患者病死率的重要手段。 全身系统性炎症反应的发生取决于机体的免疫系统。传统上免疫系统分为天然免疫和获得性免疫。我们课题组前期工作表明猕猴IIR后并发SIRS及MODS的发病过程中，肠粘膜TLRs-NF-κB-炎症介质信号转导通路全面激活，但IgA、SC、SIgA均显著减少，表现为肠粘膜过强天然免疫与降低的获得性体液免疫共同存在。IFN-γ是免疫炎症反应的一种重要调控因子，对天然免疫和获得性免疫均有调控作用，但IFN-γ是否参与IIR后肠粘膜免疫反应及SIRS的形成?如果参与，是通过何种机制?细胞因子常与其它激素，神经肽、神经递质共同组成细胞间信号分子系统，如果IFN-γ参与了肠黏膜免疫活动，生长抑素(somatostatin，SST)是否影响IFN-γ的产生?通过这方面的研究，以期增进我们对IIR后肠黏膜免疫的认识，并为防治SIRS、MODS提供新的思路。 急性重症胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是导致IIR的常见病因，在SAP—IIR—MODS的发生中，IIR反过来对胰腺组织病理及功能又有何影响?自SST用于治疗SAP以来，有效降低了MODS发病率。SST的这些作用究竟仅仅是因为抑制了胰酶分泌，还是可以避免IIR后SIRS对胰腺的再次打击?这方面的研究将更新临床防治MODS或SAP的思路，并增加我们对SST在抗炎药理方面的认识。 传统认为，B细胞介导的获得性免疫在肠粘膜免疫中具有重要的作用。我们研究小组前期的实验表明IIR后，大鼠肠淋巴细胞归巢增加，猕猴PP(peyer’s patches，PP)内B细胞明显增多，但是肠粘膜获得性体液免疫效应却表现为sIgA减少。新近研究表明，B淋巴细胞具有获得性免疫及天然免疫的双重功能。那么IIR时PP内大量集聚的B细胞是否参与肠黏膜增强天然免疫的形成?如果有，是哪一类或哪一发育阶段的B细胞?参与天然免疫的B细胞是否包括具有免疫记忆的B淋巴母细胞?这些研究能增进我们对临床防治SIRS及MODS分子靶点的新认识。 方法： 1．实验动物：全部实验所用健康成年猕猴来自成都野生动物世界，雌雄不限，体重6.9±1.7Kg。猕猴进出成都野生动物世界猕猴喂养区时均检疫合格。 2．实验分组：15只健康成年猕猴随机分为正常、IIR、IIR+SST三组，每组5只动物。肠缺血再灌注手术：肌注复方二甲苯胺噻嗪(0.06～0.24ml／kg)麻醉动物，实验过程中用安定静注0.16±0.09mg／kg／h维持昏睡状态。无菌铺巾，沿腹正中切开，分离肠系膜上动脉后予以夹闭，60 min后松夹进行再灌注，恢复肠系膜上动脉血流。再灌注后1h，静脉输入0.9％盐水，0.1～0.2ml／kg／min，24h内补入葡萄糖20g。 3．预防使用SST：在夹闭肠系膜上动脉前，从静脉滴注生长抑素，5μg／kg／h，持续至再灌注后24h。 4．HE染色法观察回肠、胰腺组织病理损伤程度。 5．放射免疫分析检测外周血SST的含量。 6．ELISA检测肠上皮细胞、肠淋巴细胞、肠淋巴细胞孵育上清液、回肠组织匀浆、外周血清、门静脉血清中IFN-γ的水平。 7．ELISA检测外周血清及回肠组织匀浆中IL-1β、IL-6、TNF-α水平。 8．酶比色法检测血清淀粉酶及脂肪酶。 9．免疫组化检测IFN-γ、CD4、CD8、CD57、CD20、CD5、PAX-5、浆细胞、TLR4、TLR2、NF-κB、integrinα4β7的分布，图像分析软件测定阳性面积及IOD值。 10．门静脉血培养。 11．培养人B淋巴母细胞株hmy2.cir，细胞干预组加入LPS(10μg／ml)，另一组为无干预的空白对照组，37℃，5％CO_2孵育。 12．ELISA检测干预24小时后培养上清液中IL—6及干预72小时后培养上清液中IgM的水平。 13．免疫荧光检测hmy2.cir细胞TLR2、TLR4表达。 14．MTT检测LPS干预hmy2.cir细胞株后24小时、48小时、72小时的增殖情况 结果： 1．IIR后回肠粘膜上皮细胞、门静脉血内IFN-γ水平较正常组显著增加(分别为30.7±20.1 pg／mg vs 9.4±2.4pg／mg总蛋白；18.1±1.1pg／ml vs 8.7±1.3 pg／m1)，p＜0.05，而肠淋巴细胞及其上清液的IFN-γ水平较正常组明显降低(分别为1.7±0.02pg／mg vs 11.1±4.0pg／mg总蛋白；2.2±0.3pg／mg ys 5.2±1.5pg／mg)(p＜0.05)； 2．预防性给予SST后，与IIR组比较，回肠上皮细胞及门静脉血内IFN-γ的水平显著下降(分别为13.6±4.9pg／mg总蛋白，p=0.055；8.9±2.5pg／ml，p＜0.05)，肠淋巴细胞及其上清液的IFN-γ水平无明显变化； 3．组织匀浆及外周血的IFN-γ水平在三组间无明显差别。CD4~+细胞、CD57~+细胞分布与IFN-γ无关，CD8~+细胞分布与IFN-γ变化趋势相反。 4．IIR后小肠黏膜PP数量增加、增大。 5．正常组猕猴肠黏膜PP内的B细胞均为PAX-5~+ CD20~+ CD5~-，系B-2细胞，黏膜固有层有散在浆细胞。IIR后PP内PAX-5~+细胞显著增加(p＜0.05)，但其中CD20表达未见增多，CD5~-表达，出现PAX-5~+ CD20~- CD5~-的祖B细胞，黏膜固有层内浆细胞显著减少(p＜0.05)。 6．正常时，PP中TLR2、TLR4、NF-κB及IFN-γ表达均较弱，IIR时PP内四种分子表达均明显增强。 7．正常PP内有散在α4β7表达，IIR组明显减少。 8．IIR后，猕猴外周血及回肠黏膜组织中炎症介质IL-1β(外周血：79.2±14.4ng／ml；回肠：294.0±46.4pg／g)、IL-6(外周血：1261±297.5ng／ml；回肠：1527±160.8p／g)、TNF-α(外周血：64.8±18.7ng／ml；回肠：213.2±29.2pg／g)，与正常组IL-1β(外周血：27.3±7.17ng／ml；回肠：82.8±20.5pg／g)、IL-6(外周血：13.9±10.50ng／ml；回肠：709.6±211.2pg／g)、TNF-α(外周血：3.04±1.01ng／ml；回肠：56.0±10.04pg／g)比较，均显著增加(p＜0.05)。SST治疗后，外周血中IL-1β(40.0±9.9ng／ml)、IL-6(244.4±70.0 ng／ml)、TNF-α(19.2±10.1 ng／ml)水平明显下降，与IIR组相比有显著性差异(p＜0.05)。 9．正常组5只动物的门静脉血培养均为阴性；IIR组所有猕猴血培养均有细菌生长，阳性率为100％，而且引起菌血症的细菌均为大肠杆菌。 10．LPS干预72小时后，hmy2.cir细胞上清液中IgM水平为0.528±0.002 ng／ug总蛋白，与空白对照组(0.617±0.057ng／ug总蛋白)相比显著减少(p＜0.05)。 11．LPS干预72小时后，与对照组相比，hmy2.cir细胞TLR4的IOD(1201.3±913.4 vs 5078.2±2483.2)及TLR2的IOD(174.8±80.2 vs 1463.5±51.2)较对照组显著减少(p＜0.05)。 12．LPS干预24小时后，hmy2.cir细胞上清液中IL-6水平(0.528±0.002 pg／ug总蛋白)与空白对照组(0.406±0.218pg／ug总蛋白)相比显著减少(p＜0.05)。 13．LPS干预24小时后，hmy2.cir细胞增殖水平(0.389±0.061)较空白对照组(0.727±0.245)为低，72小时后细胞增殖水平(0.562±0.219)较对照(0.173±0.079)显著增加(p＜0.05)。 14．IIR后，所测胰淀粉酶(2 492.0±2 102.8 IU／L vs 385.4±136.1 IU／L)及脂肪酶(1 278.0±1 446.3 IU／L VS 25.8±13.0 IU／L)在血中水平较正常组均显著升高(p＜0.05)。预防性使用SST，既使发生IIR，血胰淀粉酶(567.0±338.0 IU／L)及血脂肪酶(77.2±779 IU／L)明显回落。 15．放射免疫分析结果表明，IIR后外周血SST(62.17±13.56 pg／ml)较正常对照(160.61±33.84 pg／ml)明显下降(p＜0.05)，静脉补充SST后，循环SST水平(156.32±30.25 pg／ml)显著回升(p＜0.05)。 16．IIR时可见胰腺组织病理损伤。预防性使用SST后，胰腺病理组织学较IIR时明显减轻，组织学评分从+++降到++。 结论： 1．IIR后，来源于上皮细胞及早期祖B细胞大量产生IFN-γ，后果是通过肠、黏膜、肺泡肥大细胞上的FcεRIα活化肥大细胞，引起强烈的天然免疫反应。换言之，IFN-γ将TLR-NF-κB与肥大细胞两个天然免疫反应通路联系在一起，构成了复杂、高效的天然免疫网络。 2．IIR后祖B细胞参与肠黏膜天然免疫反应，在肠黏膜屏障严重损伤时常伴发LPS血症，这使得LPS可在循环甚至骨髓中通过祖B细胞的TLR介导使祖B细胞迅速卷入天然免疫，在循环中产生大量IL-1β、IL-6、TNF-α，这应是SIRS发生的重要原因之一。 3．IIR后肠黏膜PP内PAX-5~+ CD20~+ CD5~-、具有免疫记忆的B淋巴母细胞并未在强烈、快速反应的天然免疫中发挥明显作用。 4．整个B淋巴细胞群具有天然免疫及获得性免疫的双重功能。在不同发育阶段的B淋巴细胞仅分别发挥其中某一项功能。代表早期发育阶段的祖B淋巴细胞高表达TLRs，且能被LPS激活，经TLR-NF-κB-促炎因子途径发挥快速、强烈的天然免疫功能；成熟B细胞具有较弱的天然免疫作用，主要参与获得性免疫；代表发育晚期阶段的B淋巴母细胞虽有TLRs表达，但不能被LPS激活，不具有天然免疫功能。 5．IIR导致MODS时，胰腺应为值得重视的、早期受损的器官。其炎症组织病理改变，不是缺血后氧化应激所致，而与循环中炎症介质进入胰腺后激活NF-κB有关。SST可通过降低全身炎症反应，解除血炎症介质对胰腺的再次损伤，从而避免急性胰腺炎向重症方向发展。
【学位单位】：四川大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2007
【中图分类】：R574;R459.7
【部分图文】：

536.7士318.7#与正常比较，争<0.05;与IIR比较，卜0.05图1一1称猴小肠勃膜IFN一的表达(免疫组化，X4oo)二、ELIsA定量分析回肠、外周血及门静脉血I刚一Y水平回肠上皮细胞的丁N一下水平变化趋势同免疫组化结果，但肠淋巴细胞及其上清液的环N一下水平在IIR后明显降低勿<0.05)，预防性给予SST后，仍不能恢复到正常水平。I皿后，门静脉血IFN一Y较正常时显著升高，预防性给予SST后，正N一Y水平明显回落

结果一、称猴回肠PP结的变化与正常组比较，llR时小肠豁膜PP数量增加、增大(图2一1)。正常对照HR图2一1称猴回肠PP结的变化(HE，X100)二、PP内B淋巴细胞及固有膜内浆细胞的变化正常组称猴肠勃膜PP内的B细胞均为PAx一5+cD20+cDS一，系B一2细胞，勃膜固有层有散在浆细胞。HR时，PP内队x一5+细胞显著增加切<0.05)，但其中eDZo表达未见增多，eDS一表达?

四川大学临床医学博士专业学位论文的祖B细胞，勃膜固有层内浆细胞显著减少勿<0.05)(图2一2，表2一1)。正常对照三一讨娜扮、卜于资片万户一-一，.啥厂砖一户IIRPAX一5CD20CDS浆细胞图2一2表2一1称猴回肠PP内B细胞表面标志物及浆细胞的变化(免疫组化，x4oo)称猴回肠PP结内CD20+、队X一5+及固有膜内浆细胞免疫组化半定量分析CD20PAX一5浆细胞面积(%)IOD面积(%)IOD面积(%)IOD正常 1IR 2.2士 1.6 3.2士 1.9462.6士329.1665.5士396.9 8.3土0.66352.2土 723.60.35士 0.22199.4士117.319.1士4.8*15210.1士5433.3*0.09士0.07*52.0士44.0*与正常比较，幼<0.05三、肠乳膜正常时，pp中TLR4、TLRZ、NF一KB、IFN一丫的表达pp中TLRZ、TLR4、NF一KB及IFN一丫表达均较弱，IIR时PP内四种分子表达均明显增强(图2一3，表2一2)。
【参考文献】

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本文编号：2889284