高脂诱导肝细胞衰老中microRNA-22的作用及其分子机制

发布时间：2020-11-20 05:32

　　 目的:探究microRNA-22在高脂环境下调控肝细胞衰老的作用及其分子机制,为非酒精性脂肪性肝病寻找有效干预靶点提供基础。方法:(1)将BALB/c小鼠随机分成2组:正常饮食组和高脂饮食组,每组10只。高脂饮食组用高脂饮食喂养诱导非酒精性脂肪性肝病。20W后,处理老鼠,称量小鼠体重、肝重及附睾脂肪重量;生化试剂盒检测各组小鼠肝甘油三酯的含量;苏木紫-伊红染色检测肝脂肪变性程度;用半定量PCR检测脂代谢相关基因Lxr、Acsl、Acc1、Chrebp以及P21的mRNA水平;(2)用衰老相关β-半乳糖苷酶染色检测组织肝细胞衰老情况;免疫荧光染色检测P53、SIRT1的蛋白表达,实时定量PCR技术检测miR-22和Sirt1的相对表达量;流式微球技术检测NAFLD小鼠血清中炎性因子IL2、IL4、IL6、IFNγ、TNF、IL17A和IL10的表达。(3)细胞学实验,应用MTT法确定棕榈酸(PA)的最佳浓度;β-半乳糖苷酶染色检测PA对BNL.CL2细胞衰老的作用;qPCR检测PA处理BNL.CL2细胞后细胞周期及衰老相关基因P53、P21、Cdk2、Cdk6的相对表达量,以及miR-22、Sirt1和SASP炎性因子表达水平;免疫荧光染色检测PA处理BNL.CL2细胞后SIRT1、P53、P21的蛋白表达情况(4)瞬时转染miR-22 mimics到BNL.CL2肝细胞,检测衰老相关β-半乳糖苷酶,SIRT1、P53、P21、CDK2、CDK6以及SASP相关炎性因子的表达,方法如前所述。(5)瞬时转染miR-22 inhibitor至BNL.CL2肝细胞,6 h后,换PA处理84 h,检测衰老相关β-半乳糖苷酶、SIRT1、P53、P21、CDK2、CDK6以及SASP炎性因子的表达,方法如前所述。结果:(1)高脂饮食的BALB/c小鼠表现为体重、肝重、附睾脂肪重量增加,肝甘油三酯含量上调等脂质沉积的表现;HE染色显示肝脂肪变性,脂代谢异常的脂肪性肝病表现。(2)衰老相关β-半乳糖苷酶及衰老相关蛋白增加;免疫荧光染色显示在HFD组P53表达增加、SIRT1在核的表达下调;qPCR显示在HFD组miR-22表达增加和Sirt1表达降低;小鼠血清中炎性因子IL6、TNF的蛋白表达明显增高。(3)MTT法及β-半乳糖苷酶染色检测显示PA浓度为100μM时,作用BNL.CL2细胞84 h后,蓝染的阳性衰老细胞增多。实时定量PCR检测PA处理BNL.CL2肝细胞后,衰老相关基因P53、P21表达增加,Cdk2、Cdk6及Sirt1的表达降低,miR-22及SASP炎性因子表达上调;细胞免疫荧光染色显示PA处理BNL.CL2肝细胞后,P53、P21在核表达增加,SIRT1在胞核表达减少,在胞浆表达增多。(4)BNL.CL2细胞瞬时转染miR-22 mimics后,SIRT1表达下调且在胞核的表达较少,同PA处理结果趋势一致,衰老相关β-半乳糖苷酶及衰老相关基因和蛋白增加,细胞周期相关基因表达下调,SASP相关炎性因子上调。(5)BNL.CL2细胞瞬时转染miR-22 inhibitor后,与PA+microRNA inhibitor N.C处理组相比,PA+miR-22 inhibitor组衰老相关β-半乳糖苷酶表达减少,SIRT1表达增加且在胞核表达增多,细胞周期相关基因在mRNA水平表达上调,衰老相关基因和蛋白下调。结论:高脂环境可诱导肝细胞miR-22高表达,进而抑制SIRT1的活性,导致SASP上调,诱导肝细胞衰老。MiR-22可通过靶向调控SIRT1/SASP诱导NAFLD发生发展,其可能成为NAFLD治疗的潜在分子靶点。
【学位单位】：三峡大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R575
【部分图文】：

图 1 正常饮食组和高脂饮食组小鼠肝脏病理学表现注：HFD 肝出现明显的脂滴，CD：正常饮食组，HFD：高脂饮食组，H&E 染色：FLD 小鼠肝脂代谢及炎性因子表达用逆转录 PCR 对小鼠高脂饮食组及正常饮食组小鼠肝组织中脂代谢相csl、Acc1、Chrebp 等进行了检测。结果显示：与正常饮食组相比，Hhrebp 表达无统计学意义外，Lxr、Acsl、Acc1、Chrebp 其他基因均有明时，在高脂饮食组中 P21 和 Il1α 表达均增高。（见图 2）图 2 NAFLD 小鼠肝组织中脂代谢基因及 P21、Il1α 的 mRNA 表达量

图 1 正常饮食组和高脂饮食组小鼠肝脏病理学表现（注：HFD 肝出现明显的脂滴，CD：正常饮食组，HFD：高脂饮食组，H&E 染色：200×）1.3NAFLD 小鼠肝脂代谢及炎性因子表达利用逆转录 PCR 对小鼠高脂饮食组及正常饮食组小鼠肝组织中脂代谢相关基因Lxr、Acsl、Acc1、Chrebp 等进行了检测。结果显示：与正常饮食组相比，HFD 模型组除 Chrebp 表达无统计学意义外，Lxr、Acsl、Acc1、Chrebp 其他基因均有明显的变化。同时，在高脂饮食组中 P21 和 Il1α 表达均增高。（见图 2）

22图 3 形态学观察肝细胞衰老表征A.HFD 组肝细胞核明显增大，DAPI 染色：400×，B.HFD 组出现明显蓝染颗粒，达增加，CD：正常饮食组，HFD：高脂饮食组，衰老特异性 β-半乳糖苷酶染色：AFLD 小鼠肝中 P53 表达细胞衰老时 P53 蛋白表达增高，用石蜡切片行间接免疫荧光法检测小鼠食组肝组织中 P53 蛋白表达。结果显示：高脂饮食组肝细胞核内 P53 的高于正常对照组（见图 4）。
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本文编号：2891024