基于芳香烃受体研究葛根素和酮康唑对急性肝损伤的影响

发布时间：2020-11-20 06:53

　　 研究背景:肝损伤是临床常见疾病,尽管我们在过去几十年中对肝损伤的机制研究取得了长足进步,但是目前除了对原发病的治疗是防治肝损伤最为有效的手段外,临床上仍缺乏有效逆转肝损伤的特异药物。近些年来从中药提取物中发现了一些具有肝保护效应的药物,但这些药物的作用靶点与机制仍不明确,其临床疗效也不确切。近年来研究发现芳香烃受体(AHR)在调控肝毒性反应和疾病耐受中发挥重要作用。酮康唑(KCZ)是AHR激动剂,具有保肝和伤肝的双重效应;葛根素(PUE)同样具有保肝和伤肝的双重效应,但鲜有葛根素对AHR影响的文献报道。脂多糖(LPS)和四氯化碳(CCl4)是经典的肝毒剂;课题组在前期的实验中发现,葛根素预处理加重LPS诱导的急性肝损伤,而对CCl4诱导的急性肝损伤则没有影响;酮康唑的预处理则对LPS和CCl4诱导的急性肝损伤都有保护效应。因此,本文研究了葛根素和酮康唑对急性肝损伤的影响,并初步探索了葛根素对AHR的影响。目的:1、研究葛根素和酮康唑预处理对脂多糖诱导急性肝损伤的影响;2、研究葛根素对肝脏AHR的影响;3、研究酮康唑预处理对四氯化碳诱导的急性肝损伤的保护效应及其机制。方法:1、葛根素和酮康唑对脂多糖诱导大鼠肝损伤的作用研究SD成年大鼠,随机分为五组;(Ⅰ)空白组;(Ⅱ)模型组:尾静脉注射5mg/kg的LPS;(Ⅲ)葛根素+模型组:200mg/kg的PUE连续灌胃三天,每天一次,末次灌胃8小时后尾静脉注射5mg/kg的LPS;(Ⅳ)酮康唑+模型组:100mg/kg的KCZ连续灌胃三天,每天一次,末次灌胃8小时后尾静脉注射5 mg/kg的LPS;(V)葛根素组:200mg/kg的PUE连续灌胃三天,每天一次。LPS注射12小时后,大鼠在0.3%的戊巴比妥(1.6mL/kg)麻醉下打开腹腔,通过腹主动脉采血2mL,剪取一部分肝组织,分别冻存和用10%的中性福尔马林固定。分离血清,用自动生化分析仪立即检测肝损伤相关酶AST、ALT、LDH的活性;用试剂盒检测血清亚硝酸盐的含量;用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中活性氧(ROS)的浓度;用石蜡包埋、HE染色法检测肝组织病理学改变;用ELISA检测肝脏组织中炎性因子TNF α、IL-6的表达。2、葛根素对肝脏AHR的影响组织标本来源于第一部分实验的空白组和葛根素组。用免疫组织化学法检测肝脏组织AHR蛋白的表达;用荧光定量PCR(qPCR)法检测肝脏组织AHR、CYP1A1、UGT1A1和TIPARP基因的表达;用Western blot(WB)法检肝脏组织ER α的表达;用放射免疫法测定大鼠血清雌二醇浓度。3、酮康唑对四氯化碳诱导的大鼠肝损伤的作用研究SD大鼠,随机分为四组;(Ⅰ)空白组;(Ⅱ)模型组:腹腔注射50%(V/V)CC14-液体石蜡混合物(2ml/kg);(Ⅲ)酮康唑+模型组:100mg/kg的KCZ连续灌胃三天,每天一次,末次灌胃4小时后腹腔注射50%CCl4-液体石蜡混合物(2ml/kg);(Ⅳ)酮康唑组:1O0mg/kg的KCZ连续灌胃三天,每天一次。取动物标本12小时前大鼠禁食不禁水。注射CCl4混合物24小时后,腹腔注射0.3%的戊巴比妥(1.6mL/kg)麻醉大鼠,打开腹腔,通过腹主动脉采血2mL后;剪取一部分肝组织,分别冻存和用10%的中性福尔马林固定。分离血清,用自动生化分析仪立即检测转氨酶AST和ALT的活性;用石蜡包埋、HE染色法检测肝组织病理学改变;用试剂盒检测GSH、GSSG和GSH/GSSG的比值;用ELISA检测肝脏组织中炎性因子TNF α、IL-1 β、IL-6的浓度;用qPCR法检测肝脏组织AHR、AHRR、CYP1A1、GSR、GST α、NQO1的基因表达;用WB法检测肝脏组织中HO-1、CYP2E1全蛋白和Nrf2、NF-κ B/p65细胞核蛋白的表达。结果:1、葛根素加重脂多糖的肝毒性,酮康唑减轻脂多糖的肝毒性。(1)死亡率:造模12小时内,模型组大鼠死亡1只,葛根素+模型组大鼠死亡2只,其余组无大鼠死亡,但组间死亡率的差异无统计学意义。(2)病理切片:大鼠经LPS刺激后,模型组肝组织呈片状、桥接样坏死,细胞核固缩甚至溶解,汇管区可见炎性免疫细胞浸润。葛根素+模型组中大鼠肝组织损伤更严重,酮康唑+模型组中肝组织也有片状坏死和炎性细胞浸润,但其损伤程度轻于模型组。未见葛根素组的肝损伤。(3)酶学指标:模型组血清中AST,ALT和LDH的活性明显高于正常对照组(P0.01);葛根素+模型组的血清酶活性比模型组更高(P0.05),而酮康唑+模型组中的AST,ALT和LDH的活性低于模型组(P0.05或P0.01);与正常对照组相比,单独葛根素没有引起肝损伤相关酶活性的升高。(4)炎症相关因子:亚硝酸盐浓度检测显示,模型组明显高于正常对照组(P0.01),葛根素+模型组比模型组更高(P0.05),而酮康唑+模型组中的亚硝酸盐浓度低于模型组(P0.05)。模型组中血清ROS的水平明显高于正常对照组(P0.01);葛根素+模型组大鼠血清ROS水平比模型组更高(P0.05),酮康唑+模型组中ROS的水平低于模型组(P0.05),葛根素组与空白对照组无差异。(5)炎性因子:模型组大鼠肝脏组织中TNF α和IL-6的含量明显高于正常对照组(P0.01);葛根素+模型组肝脏组织中TNF α和IL-6的含量比模型组更高(P0.05);酮康唑+模型组中TNF α和IL-6的含量明显低于模型组(P0.05),葛根素组与空白对照组无差异。2、葛根素对AHR及其相关蛋白和基因表达的影响。大鼠连续灌胃葛根素3天后,肝组织中AHR的表达明显受到抑制,葛根素组免疫组化评分低于空白组(P0.05)。葛根素组肝脏AHR mRNA相对表达与空白组相比也受到明显的抑制(P0.05)。相反,葛根素能明显上调大鼠肝组织TiPARP mRNA的表达(P0.05)。连续服用3天的葛根素并没有明显影响大鼠血清雌二醇的含量,但是葛根素明显上调肝组织ER α的相对表达,与空白组相比差异有统计学意义(P0.05)。3、酮康唑预处理保护四氯化碳诱导的急性肝损伤(1)病理切片:CCl4刺激大鼠24后,在显微镜的低倍视野下可见大面积的肝组织损伤,高倍视野下可见肝脏结构严重破坏,气球样空泡变性以及显着的肝细胞膨胀;在酮康唑+模型组中,其肝组织损伤明显轻于模型组;未见酮康唑组的肝损伤。(2)酶学指标:模型组血清中AST和ALT水平明显升高(P0.01),酮康唑+模型组转氨酶的活性低于模型组(P0.01),酮康唑组中ALT含量轻度的升高,但与空白组相比差异无统计学意义(P0.05),酮康唑对大鼠的AST含量没有影响。(3)肝组织炎性因子和NF-κ B/p65蛋白:模型组肝组织中炎性因子含量显著高于空白组(P0.01),而酮康唑+模型组中炎性因子含量低于模型组(p0.05)。模型组细胞核内NF-κ B/p65的表达明显高于空白对照组(p0.05),酮康唑+模型组中NF-κ B/p65的表达低于模型组(p0.05)。(4)抗氧化物:模型组中GSSG的含量明显高于空白对照组(p0.01),酮康唑+模型组中GSSG含量明显低于模型组(p0.05)。模型组中GSH/GSSG 比值明显低于空白组(P0.01),酮康唑+模型组中GSH/GSSG 比值显著高于模型组(p0.05)。模型组中GSR mRNA的表达与空白对照组无差异,酮康唑+模型组中GSR mRNA的表达高于模型组(P0.05),酮康唑组GSR mRNA的表达也高于空白组(p0.05)。模型组中NQO1 mRNA的表达与空白对照组无差异,酮康唑+模型组中NQO1 mRNA的表达明显高于模型组(P0.05),酮康唑组中NQO1 mRNA的表达显著高于空白组(p0.01)。模型组中GSTα mRNA的表达显著低于空白组(p0.01),酮康唑+模型组中GSTα mRNA的表达明显高于模型组(p0.01),酮康唑组GSTα mRNA的表达与空白对照组无差异。模型组中HO-1蛋白的表达与空白对照组无差异,酮康唑+模型组中HO-1蛋白表达明显高于模型组(p0.05),酮康唑组中HO-1蛋白的表达与空白组无差异。模型组中Nrf2表达与空白对照组无差异,酮康唑+模型组中Nrf2的表达明显高于模型组(P0.05),酮康唑组中Nrf2的表达明显高于空白对照组(p0.05)。(5)AHR相关基因:模型组中AHR mRNA的表达明显低于空白对照组(p0.05),酮康唑+模型组中AHR mRNA表达明显高于模型组(p0.05),酮康唑组中AHR mRNA的表达显著高于空白对照组(P0.01)。模型组中AHRR mRNA的表达与空白对照无差异,酮康唑+模型组中AHRR mRNA的表达明显高于模型组(p0.05),酮康唑组中AHRR mRNA的表达明显高于空白对照组(p0.05)。模型组中CYP1A1 mRNA的表达与空白对照组无差异,酮康唑+模型组中CYP1A1 mRNA的表达显著高于模型组(p0.01),酮康唑组中CYP1A1 mRNA的表达显著高于空白对照组(p0.01)。(6)CYP2E1:模型组中CYP2E1的表达明显低于空白对照组(p0.05),酮康唑+模型组中CYP2E1蛋白表达与模型组无差异,与空白对照也无差异,酮康唑组中CYP2E1蛋白表达与空白对照组无差异。结论:1、在脂多糖诱导的急性肝损伤模型中,葛根素增加了肝脏的损害,促进ROS和NO的释放,增加肝脏TNF α和IL-6的浓度;表明葛根素有加重肝损伤的潜在风险。酮康唑减轻肝脏的损伤;表明适当激活AHR可以增强肝脏对脂多糖的耐受。2、葛根素抑制大鼠肝组织AHR基因和蛋白的表达,上调TIPARP mRNA的表达,促进肝组织ER α表达;提示葛根素可能是肝脏AHR的抑制剂和ER α激动剂。葛根素可能通过抑制AHR从而增加了肝脏对脂多糖的敏感性。3、酮康唑预处理减轻CCl4的肝毒性,这种保护机制可能是酮康唑预先激活了肝脏的AHR/Nrf2的信号通路,从而增强肝脏的抗炎和抗氧化能力;提示适当激活AHR可以增强肝脏对CCl4的耐受。4、适度激活AHR有助于肝脏对毒性物质的耐受,AHR的抑制增加了肝脏对脂多糖的敏感性。
【学位单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R575
【部分图文】：

图１－２、脂多糖造模１２小时后显微镜下观察各组病理变化（Ｈ?＆?Ｅ，?１００?Ｘ）。??Ｆｉｇ．?１－２：?Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ?ｐｈｏｔｏｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｌｉｖｅｒ?ｏｆ?ｒａｔｓ．??２６??

尾静脉注射脂多糖１２小时后，大鼠血清的ＡＳＴ，?ＡＬＴ和ＬＤＨ的活性明??显高于正常对照组（Ｐ＜０．０１）；和模型组相比，葛根素预处理的大鼠再受到脂??多糖的刺激后，其血清酶学水平比模型组更高（Ｐ＜〇．〇１）；酮康唑预处理组中??ＡＳＴ，?ＡＬＴ和ＬＤＨ的活性低于模型组，差异具有统计学意义（Ｐ＜?０．０５）；与??正常对照组相比，单独葛根素灌胃没有引起肝损伤相关酶学的升高。结果见表??１－３?和图?１－３。??表１－３、各组肝损伤相关酶学的血清活性（ｍｅａｎｓ?土?ＳＤ）??Ｔａｂｌｅ?１－３．?Ｓｅｒｕｍ?ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａＩ?ｍａｒｋｅｒｓ?ｒｅ?Ｉａｔｅｄ?ｔｏ?ｈｅｐａｔｏｃｅ?Ｉ?ＩｕＩａｒ?ｎｅｃｒｏｓ?ｉ?ｓ．??组别?数量?ＡＳＴ?（Ｕ／Ｌ）?ＡＬＴ?（Ｕ／Ｌ）?ＬＤＨ?（Ｕ／Ｌ）???对照?１２?８７．３±４．５?２３．７土?１．６?２Ｉ６±１４．２??模型?１１?５０４．５±６０．广?５０３．?１±６３＿３＝?１１４６．５±９０．扩??葛根素＋模型?１０?９１４．２±１０１．８＿?９７３．?４±８１．?２＊?１８４８．?９±?１７８．?５＿??酮康唑＋模型?１２?２９７．６?士?２８’?２６９．４?土?３４．?１＊?６４０．６±４５．４＊＊??葛根素?１２?８５．９±３．９?２４．?７±１．?７?２１１．?９±１１．?７???注：各组方差差异大，采用Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ秩和检验。＂Ｐ?＜?０．?０１：与对照组相比＜０．?０５，??＊＊Ｐ?＜?０．０５：与模型组相比。??１２００－１?＊?１２００－１?＊?－

广州中医药大学２０１９屈博士学位论文Ｍ处理组中亚硝酸盐的含Ｍ低于模型组，差异苻统计学意义（Ｐ＜０对照组相比，单独葛根素灌胃没有引起亚硝酸盐含量的升高。结果图?１－４。??表１－４、各组血清亚硝酸盐的含量（ｍｅａｎｓ?土?ＳＤ）??Ｔａｂｌｅ?１－４．?Ｌｅｖｅｌｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｓｅｒｕｍ?ｎｉｔｒｉｔｅ??数量?Ｎｉｔｒｉｔｅ?（?ｗＭ）??１２?１．３?±０．１３??１１?３０．６±２．８＝??＋模型?１０?４４．５±３．／Ｔ??＋模型?１２?２２．?９±２．矿???１２?０．９２?士?０．?１据符合正态分布，方差齐，用方差分析；＝Ｐ?＜?０．０１：与对照组相比，卞＜?０与模型组相比。??６０
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本文编号：2891114