戊型肝炎病毒ORF2蛋白与猪肝细胞蛋白相互作用的研究

发布时间：2020-12-22 20:43

　　戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus，HEV）是戊型肝炎（Hepatitis E，HE）的病原体，主要经粪口途径传播。HEV为单股正链无包膜RNA病毒，基因组长约7.2Kb，包含三个开放编码区，ORF1、ORF2、ORF3，其中ORF2蛋白为病毒衣壳的主要成份，衣壳蛋白与宿主细胞的特异性结合启动HEV的复制过程，是决定HEV对宿主细胞亲嗜性的首要步骤。哺乳动物HEV有4个基因型（1-4型），4种型别之间HEV核苷酸序列的相似性在80%左右，但宿主范围有一定差异，1型和2型HEV只感染人，3型和4型HEV既感染人也感染猪，并且猪是其主要的储存宿主。本课题拟通过对HEV与猪肝蛋白相互作用的研究，筛选并确认与HEV有特异性结合作用的猪肝蛋白，分析这些蛋白在病毒复制过程中的作用，进一步通过比较基因1型、4型HEV与猪肝蛋白结合能力的差异，分析HEV宿主限制性及跨种属感染的机制。我们利用分裂-泛素酵母双杂交系统，分别以基因1型HEV ORF2和基因4型HEVORF2蛋白为诱饵对猪肝脏cDNA文库进行筛选，经过三次文库筛选，运用酵母共转化实验去除酵母双杂交假阳性结果，得到与1型HEV ... 

【文章来源】：中国食品药品检定研究院北京市

【文章页数】：69 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
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中文摘要
Abstract
一 前言
    1.1 HEV 的基本病毒学特性
    1.2 HEV 基因型及不同基因型的地理分布
    1.3 HEV 在动物中的流行、传播途径及跨种属感染的潜在可能
    1.4 本课题的研究目的和内容
二 实验材料、试剂和仪器
    2.1 材料
        2.1.1 酵母双杂交系统
        2.1.2 化学发光免疫共沉淀系统
    2.2 试剂及配制
        2.2.1 试剂
        2.2.2 试剂配制
    2.3 仪器
三 实验技术
    3.1 分裂‐泛素酵母双杂交实验技术
    3.2 化学发光免疫共沉淀技术
四 实验方法
    4.1 酵母双杂交实验
        4.1.1 诱饵质粒的构建及扩增
        4.1.2 诱饵质粒转化酵母报告株 NMY51
        4.1.3 酵母双杂交诱饵质粒功能性验证
        4.1.4 酵母双杂交筛选压力的确定
        4.1.5 酵母双杂交筛选猪肝脏 cDNA 文库
        4.1.6 阳性克隆的确认以及捕获质粒的提取
        4.1.7 酵母双杂交共转化实验
        4.1.8 对 pPR3N-Prey 中的捕获基因进行测序和序列分析
    4.2 化学发光免疫共沉淀实验
        4.2.1 pAcGFP1‐Bait 和 pProlabel‐Prey 质粒的构建
        4.2.2 AcGFP1‐Bait 和 ProLabel‐Prey 共转染 293FT 细胞
        4.2.3 化学发光免疫共沉淀实验
    4.3 ORF2 蛋白与肝细胞相互作用蛋白的生物信息学分析
五 实验结果
    5.1 酵母双杂交筛选实验结果
        5.1.1 酵母双杂交诱饵质粒大量提取后鉴定及定量
        5.1.2 酵母报告株 NMY51 转化诱饵质粒后菌落 PCR 鉴定
        5.1.3 诱饵质粒功能性验证
        5.1.4 酵母双杂交文库筛选压力选择
        5.1.5 酵母双杂交筛选与 HEV ORF2 相互作用的猪肝细胞文库
        5.1.6 捕获蛋白亚细胞定位
    5.2 化学发光免疫共沉淀
        5.2.1 化学发光免疫共沉淀质粒的构建
        5.2.2 化学发光免疫共沉淀质粒表达鉴定
        5.2.3 化学发光免疫共沉淀结果
        5.2.4 相互作用蛋白功能富集聚类分析
        5.2.5 捕获蛋白与基因 1 型、4 型 HEV ORF2 结合力的比较
讨论
小结
参考文献
论文综述
    参考文献
致谢



本文编号：2932405