蝎活性多肽Mucroporin-M1激活MAPK通路抑制HBV复制研究

发布时间：2021-01-30 07:14

　　乙型肝炎病毒是一种具有嗜肝性的,不引起细胞病变的DNA病毒,大约5-10%的成人感染和90-95%的新生胎儿感染会转为持续的感染。这些持续的感染人群具有极大地危险转化为慢性肝炎,肝硬化甚至肝癌。乙型肝炎病毒侵染导致的疾病已经成为了一种世界范围内的主要健康问题。虽然治疗性的核苷类似物和干扰素被用于乙型肝炎病毒感染者的治疗,但是乙型肝炎感染者人数和乙型肝炎相关的死亡人数逐年递增。因此,发展新的治疗药物或备选资源十分重要。本实验室近期从蝎毒腺cDNA文库中筛选得到了一些阳离子宿主防御肽基因。根据这些基因序列化学合成多肽,并且测试了它们的抗乙型肝炎病毒活性。结果发现细尖狼蝎活性多肽Mucroporin-M1能够有效的抑制乙型肝炎病毒表面抗原和早期抗原的表达。因此,对蝎活性多肽Mucroporin-Ml的抗HBV作用进行了进一步的研究。首先在乙型肝炎病毒稳转细胞系HepG2.2.15中检测了Mucroporin-M1对乙型肝炎病毒复制的抑制效应。结果显示,Mucroporin-M1能够浓度依赖性的抑制乙型肝炎病毒表面抗原,早期抗原以及病毒子代DNA在细胞上清中的表达和复制。与此同时,在HepG2... 

【文章来源】：武汉大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：114 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
论文创新点
摘要
Abstract
第一章 前言
    1 HBV的研究概况
        1.1 HBV病毒以及在体内外的感染
            1.1.1 HBV的结构与组成
            1.1.2 HBV传播模式和宿主范围
            1.1.3 HBV的体内外感染
        1.2 HBV复制周期
            1.2.1 吸附和进入
            1.2.2 松弛环状DNA的入核
            1.2.3 共价闭合环状DNA的形成和维持
            1.2.4 病毒RNA复制
            1.2.5 病毒子代DNA合成
        1.3 乙型肝炎的治疗与研究
    2 MAPK-HNF4α通路与与HBV复制的相互关系
        2.1 MAPK-ERK通路
        2.2 MAPK-JNK通路
        2.3 MAPK-p38通路
        2.4 MAPK-HNF4α通路与HBV复制的关系
    3 阳离子宿主防御肽抗病毒研究概况
    4 本工作出发点
第二章 抗HBV多肽Mucroporin-M1的筛选
    2.1 引言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 实验材料,试剂和仪器
            2.2.1.1 细胞系
            2.2.1.2 细胞培养基以及相关溶液配制
            2.2.1.3 蝎毒素多肽的合成
            2.2.1.4 Elisa试剂盒
            2.2.1.5 实验仪器
        2.2.2 实验方法
            2.2.2.1 细胞培养
            2.2.2.2 多肽抑制HBV活性筛选
            2.2.2.3 多肽序列分析
    2.3 实验结果
        2.3.1 Mucroporin-M1以及其他多肽的分离鉴定
        2.3.2 抗HBV多肽Mucroporin-M1的鉴定
    2.4 讨论
第三章 Mucroporin-M1多肽体外抑制HBV的复制
    3.1 引言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 实验材料,试剂和仪器
            3.2.1.1 细胞系
            3.2.1.2 质粒
            3.2.1.3 抗体
            3.2.1.4 试剂和试剂盒
            3.2.1.5 实验仪器
        3.2.2 实验方法
            3.2.2.1 大肠杆菌感受态制备
            3.2.2.2 细胞毒性检测
            3.2.2.3 细胞上清HBeAg和HBsAg检测
            3.2.2.4 细胞上清中的HBV DNA检测
            3.2.2.5 Western blot检测HBV Core蛋白
            3.2.2.6 Northern blot 检测 HBV RNA
            3.2.2.7 Southern blot 检测 HBV DNA
    3.3 实验结果
        3.3.1 Mucroporin-M1对细胞生长的影响
        3.3.2 Mucroporin-M1对细胞上清中病毒的抑制效应
            3.3.2.1 Mucroporin-M1对细胞上清中HBeAg和HBsAg的抑制效应
            3.3.2.2 Mucroporin-M1对细胞上清中HBV DNA的抑制效应
        3.3.3 Mucroporin-M1对细胞内HBV病毒的抑制
            3.3.3.1 Mucroporin-M1抑制细胞内HBV Core蛋白的表达
            3.3.3.2 Mucroporin-M1对细胞内HBV DNA的浓度依赖抑制效应
            3.3.3.3 Mucroporin-M1抑制细胞内HBV RNA的表达
    3.4 讨论
第四章 Mucroporin-M1多肽抑制小鼠体内HBV的复制
    4.1 引言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 实验材料,试剂和仪器
            4.2.1.1 实验动物
            4.2.1.2 实验试剂和材料
        4.2.2 实验方法
            4.2.2.1 BALB/c小鼠急性HBV感染模型构建及多肽处理
            4.2.2.2 小鼠血液中HBeAg和HBsAg抗原检测
            4.2.2.3 组织切片和免疫组化
    4.3 实验结果
        4.3.1 Mucroporin-M1多肽对小鼠血清中HBeAg和HBsAg的抑制
        4.3.2 Mucroporin-M1多肽抑制小鼠肝细胞中HBcAg的表达
    4.4 讨论
第五章 Mucroporin-M1体外抑制HBV复制的作用机制
    5.1 引言
    5.2 材料与方法
        5.2.1 实验材料,试剂和仪器
            5.2.1.1 质粒
            5.2.1.2 试剂
            5.2.1.3 试剂盒
            5.2.1.4 实验仪器
        5.2.2 实验方法
            5.2.2.1 细胞总RNA的提取
            5.2.2.2 cDNA一链的反转录合成
            5.2.2.3 实时定量PCR
            5.2.2.4 超纯质粒的提取
            5.2.2.5 双荧光素酶实验
            5.2.2.6 凝胶阻滞实验
            5.2.2.7 Western blot检测HNF4α
            5.2.2.8 细胞MAPK通路的检测
            5.2.2.9 MAPK抑制剂对HBV DNA影响的检测
    5.3 实验结果
        5.3.1 Mucroprin-M1多肽抑制HBV病毒启动子转录活性
        5.3.2 Mucroprin-M1对反式转录因子结合HBV启动子顺式元件的影响
        5.3.3 Mucroprin-M1抑制HNF4α的表达
        5.3.4 Mucroprin-M1对MAPK通路的激活作用
        5.3.5 MAPK通路抑制剂对Mucropr in-M1激活MAPK通路作用的阻断
    5.4 讨论
第六章 Mucroporin-M1抑制小鼠体内HBV复制的作用机制
    6.1 引言
    6.2 材料与方法
        6.2.1 实验材料,试剂和仪器
            6.2.1.1 实验动物
            6.2.1.2 实验试剂和材料
        6.2.2 实验方法
            6.2.2.1 BALB/c小鼠急性HBV感染模型构建及多肽处理
            6.2.2.2 小鼠肝脏细胞蛋白提取和制样
            6.2.2.3 Western blot检测MAPK蛋白和HBV Core蛋白
    6.3 实验结果
    6.4 讨论
实验总结与展望
参考文献
博士期间发表论文以及获得专利
致谢



本文编号：3008489