Nrf2在酒精致L02细胞损伤中的作用机制研究

发布时间：2021-03-07 05:20

　　目的:探究酒精对人肝L02细胞的损伤作用及Nrf2在酒精致肝细胞损伤过程中的作用机制。方法:用RNA干扰的方法下调L02细胞内Nrf2的表达,用于转染L02细胞的Nrf2-si RNA序列是,sense:5’-CCAGAACACUCAGUGGAAUTT-3’;antisense:5’-AUUCCACUGAGUGUUCUGGTT-3’。用RT-PCR法检测L02细胞内Nrf2在m RNA水平的表达,Western blot法检测L02细胞内Nrf2在蛋白水平的表达。MTT法检测L02细胞生存率的变化。比色法检测L02细胞谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性。羟胺法检测L02细胞超氧化物歧化酶（SOD）的活性。DCFH-DA染色荧光显微镜观察L02细胞内活性氧（ROS）的含量和分布,DCFH-DA染色流式细胞仪定量测定L02细胞内ROS的含量。DAPI染色荧光显微镜观察L02细胞核形态的改变并由此判断细胞凋亡的变化。Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测L02细胞的凋亡率。结果:1.用不同浓度酒精处理L02细胞24 h,MTT法测定细胞生存率。结果显示,与0mmol/L酒... 

【文章来源】：河南大学河南省

【文章页数】：80 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

酒精对L02细胞生存率的影响（x±s,n=5）

Nrf2在酒精致L02细胞损伤中的作用机制研究223.2不同浓度酒精对L02细胞质内Nrf2蛋白表达量的影响用含不同浓度酒精的去血清培养液处理L02细胞3h，对照组的培养液含血清不加酒精。提取细胞质蛋白后，Westernblot法检测，结果如图3-2所示，与0mmol/L酒精组相比，随着酒精浓度的增加，细胞质内Nrf2蛋白的表达量减少。图3-2酒精对L02细胞胞质Nrf2蛋白表达量的影响（x±s,n=3）3.3不同浓度酒精对L02细胞核内Nrf2蛋白表达量的影响将L02细胞用含不同浓度酒精的去血清培养液处理3h，对照组的培养液含血清不加酒精。提取细胞核蛋白后，Westernblot法检测，结果如图3-3所示，与0mmol/L酒精组相比，随着酒精浓度的增加，细胞核内Nrf2蛋白的表达量增多。酒精(mmol/L)-actinControl0100200400Nrf242KD100KD酒精(mmol/L)Control0100200400Nrf2-actin42KD100KD

3实验结果23图3-3酒精对L02细胞核内Nrf2蛋白表达量的影响（x±s,n=3）3.4siRNA载体的构建与表达检测将培养的L02细胞分为对照组、siRNA转染试剂组、阴性对照组、阳性对照组（GAPDH-siRNA）以及Nrf2-siRNA实验组，用含血清的培养液培养。相应的试剂处理L02细胞24h，提取RNA，用RT-PCR法检测mRNA表达水平的变化；处理48h，提取蛋白质，用Westernblot法检测蛋白质表达水平的变化。3.4.1RT-PCR检测mRNA水平变化如图所示（图3-4），与对照组相比，Nrf2siRNA实验组的Nrf2mRNA的表达量显著下调，其他组的Nrf2mRNA的表达量没有明显的变化。作为内参基因的GAPDH-siRNA阳性对照组GAPDHmRNA表达量明显下调，表明实验过程中转染、RNA提取及检测方法的可靠性和有效性。酒精(mmol/L)Control0100200400Nrf2LaminB168KD100KD酒精(mmol/L)Control0100200400Nrf2LaminB168KD100KD

【参考文献】：
期刊论文
[1]HBV感染患者氧化应激状态与病毒基因型和耐药突变的相关性[J]. 杨渝伟,陈小红,彭玲,唐洁,俸家富.  检验医学与临床. 2018(04)
[2]Nrf2在神经退行性疾病中的作用及激活剂的研究进展[J]. 赵春阳,王晓良,彭英.  药学学报. 2015(04)
[3]Pathogenesis of alcoholic liver disease:Role of oxidative metabolism[J]. Elisabetta Ceni,Tommaso Mello,Andrea Galli.  World Journal of Gastroenterology. 2014(47)
[4]Oxidative stress as a crucial factor in liver diseases[J]. Halina Cichoz-Lach,Agata Michalak.  World Journal of Gastroenterology. 2014(25)
[5]Nrf2/ARE信号通路及其调控的抗氧化蛋白[J]. 李航,段惠军.  中国药理学通报. 2011(03)

硕士论文
[1]酒精致肝L02细胞损伤与Nrf2通路关系研究[D]. 李晓华.河南大学 2018



本文编号：3068470