乙肝病毒抗原基因真核表达载体的构建及表达
发布时间：2021-04-16 17:34
目的:HBV不能在体外培养,其感染宿主范围窄,动物模型缺乏,制约了HBV研究方法的进展。将携带HBV基因的质粒转染入靶细胞,建立表达HBV相关蛋白的体外细胞模型对研究HBV相关疾病的发病机制及各基因产物的生物学功能有很大帮助。我们采用PCR方法分别扩增HBV的四种抗原基因片段,通过中间载体pEASY-T1 Simple,构建包含四种抗原基因的重组真核表达质粒,并转染肝母细胞瘤细胞HepG2,同时转染正常肝细胞LO2作为对照,监测抗原的表达,为研究各抗原的生物学功能及其与免疫细胞的相互作用奠定了实验基础。方法:⒈包含HBV的各抗原基因片段的重组质粒的构建（1）采用PCR方法分别扩增HBV的各抗原基因片段（2）通过中间载体pEASY-T1 Simple,构建分别包含四种抗原HBsAg,HBeAg,HBcAg,HBeAg（P22）基因的重组真核表达质粒。（3）重组质粒的双酶切,DNA测序鉴定。2、瞬时转染细胞模型的建立:（1）转染方法:采用脂质体转染法将各重组质粒转染入肝母细胞瘤细胞HepG2,同时转染正常肝细胞LO2作为对照,建立表达HBV抗原基因的体外真核细胞模型。根据转染质粒的不同,将...
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
【文章页数】：51 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PCR扩增HBV各抗原基因片段Figure1-1PCRamplificationofHBVantigengenesLane1:DNAMarkerDL2000；
CMV-tag2B-HBsAg，pCMV-tag2B-HBeAg，pCMV-tag2B- HBcAg- HBeAg(P22)真核表达载体的构建粒 pcDNA3.1-HBV 为模板，用相应的上下游引物配对分别扩增出 549bp，581bp 大小的 HBsAg，HBeAg,HBcAg, HBeAg(P22)基因片段）。对应 PCR 产物和 T 载体 pEASY-T1 Simple 连接后中间克隆载体双酶切鉴定，片段大小与预期相符（图 1-3,图 1-4）。酶切正确后回收，与经相同酶切线性化的载体 pCMV-tag2B 分别经 T4 DNA 连接化 JM109 大 肠 杆 菌 ， 从 而 得 到 重 组 质 粒 pCMV-tag2B--tag2B-HBeAg，pCMV-tag2B-HBcAg，pCMV-tag2B-HBeAg(P22)。重组定结果表明片段大小与预期相符（图 1－5，图 1-6）。在 GenBan的 DNA 序列测定结果进行同源性分析，结果表明 HBsAg，HBeAg，g(P22)的基因和蛋白序列与基因序列号为 U 95551 的 HBV 克隆质粒完
26图1-3 中间克隆载体双酶切鉴定Fig1-3 Identifaction of recombinant plasmidsby enzyme digestionLane 1：DNA Marker DL2000；Lane 2：pEASY-T1 Simple-HBs；Lane 3：pEASY-T1 Simple-HBeAg gene；Lane 4：pEASY-T1 Simple-HBcAg图1-4 中间克隆载体双酶切鉴定Fig1-4 Identifaction of recombinant plasmidsby enzyme digestionLane 1： DNA Marker Ⅲ;Lane 2：pEASY-T1 Simple-HBeAg(P22)图1-5 重组真核表达质粒双酶切鉴定Fig1-5 Identifaction of recombinant eukaryoticexpression plasmids by enzyme digestionLane1: DNA Marker DL2000；Lane2:pCMV-tag2B-HBs；Lane3:pCMV-tag2B-HBe；Lane4:pCMV-tag2B-HBc；Lane5: pCMV-tag2B vector；Lane6: λ-EcoT14 I digest DNA Marker图1-6 重组真核表达质粒双酶切鉴定Fig1-6 Identifaction of recombinanteukaryotic expression plasmids byenzyme digestionLane1: DNA Marker Ⅲ;Lane2:pCMV-tag2B-HBeAg(P22)2.2 脂质体瞬时转染效率的鉴定取 pCMV-tag2B-HBsAg，pCMV-tag2B-HBeAg，pCMV-tag2B-HBcAg，pCMV-tag2B-HBeAg(P22)分别与 pEGFP-C1 共转染肝癌细胞株 HepG2，于转染后 24，48,72h 分别观察 pEGFP-C1 细胞中 GFP 的表达。结果显示转染后三个时间点，HepG2 细胞均有 GFP 的大量表达，且荧光表达较强，说明转染成功（图 1-7）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]Recognition of HBV antigens and HBV DNA by dendritic cells[J]. Guang-Ying Cui and Hong-Yan Diao State Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Infectious Disease,First Affiliated Hospital,Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou 310003,China. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 2010(06)
[2]The Immune Response Induced by Hepatitis B Virus Principal Antigens[J]. Chien-Fu Huang,Shih-Shen Lin,Yung-Chyuan Ho. Cellular & Molecular Immunology. 2006(02)
本文编号：3141869
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
【文章页数】：51 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PCR扩增HBV各抗原基因片段Figure1-1PCRamplificationofHBVantigengenesLane1:DNAMarkerDL2000；
CMV-tag2B-HBsAg，pCMV-tag2B-HBeAg，pCMV-tag2B- HBcAg- HBeAg(P22)真核表达载体的构建粒 pcDNA3.1-HBV 为模板，用相应的上下游引物配对分别扩增出 549bp，581bp 大小的 HBsAg，HBeAg,HBcAg, HBeAg(P22)基因片段）。对应 PCR 产物和 T 载体 pEASY-T1 Simple 连接后中间克隆载体双酶切鉴定，片段大小与预期相符（图 1-3,图 1-4）。酶切正确后回收，与经相同酶切线性化的载体 pCMV-tag2B 分别经 T4 DNA 连接化 JM109 大 肠 杆 菌 ， 从 而 得 到 重 组 质 粒 pCMV-tag2B--tag2B-HBeAg，pCMV-tag2B-HBcAg，pCMV-tag2B-HBeAg(P22)。重组定结果表明片段大小与预期相符（图 1－5，图 1-6）。在 GenBan的 DNA 序列测定结果进行同源性分析，结果表明 HBsAg，HBeAg，g(P22)的基因和蛋白序列与基因序列号为 U 95551 的 HBV 克隆质粒完
26图1-3 中间克隆载体双酶切鉴定Fig1-3 Identifaction of recombinant plasmidsby enzyme digestionLane 1：DNA Marker DL2000；Lane 2：pEASY-T1 Simple-HBs；Lane 3：pEASY-T1 Simple-HBeAg gene；Lane 4：pEASY-T1 Simple-HBcAg图1-4 中间克隆载体双酶切鉴定Fig1-4 Identifaction of recombinant plasmidsby enzyme digestionLane 1： DNA Marker Ⅲ;Lane 2：pEASY-T1 Simple-HBeAg(P22)图1-5 重组真核表达质粒双酶切鉴定Fig1-5 Identifaction of recombinant eukaryoticexpression plasmids by enzyme digestionLane1: DNA Marker DL2000；Lane2:pCMV-tag2B-HBs；Lane3:pCMV-tag2B-HBe；Lane4:pCMV-tag2B-HBc；Lane5: pCMV-tag2B vector；Lane6: λ-EcoT14 I digest DNA Marker图1-6 重组真核表达质粒双酶切鉴定Fig1-6 Identifaction of recombinanteukaryotic expression plasmids byenzyme digestionLane1: DNA Marker Ⅲ;Lane2:pCMV-tag2B-HBeAg(P22)2.2 脂质体瞬时转染效率的鉴定取 pCMV-tag2B-HBsAg，pCMV-tag2B-HBeAg，pCMV-tag2B-HBcAg，pCMV-tag2B-HBeAg(P22)分别与 pEGFP-C1 共转染肝癌细胞株 HepG2，于转染后 24，48,72h 分别观察 pEGFP-C1 细胞中 GFP 的表达。结果显示转染后三个时间点，HepG2 细胞均有 GFP 的大量表达，且荧光表达较强，说明转染成功（图 1-7）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]Recognition of HBV antigens and HBV DNA by dendritic cells[J]. Guang-Ying Cui and Hong-Yan Diao State Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Infectious Disease,First Affiliated Hospital,Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou 310003,China. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 2010(06)
[2]The Immune Response Induced by Hepatitis B Virus Principal Antigens[J]. Chien-Fu Huang,Shih-Shen Lin,Yung-Chyuan Ho. Cellular & Molecular Immunology. 2006(02)
本文编号：3141869
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/xiaohjib/3141869.html
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